Caspase酶對(duì)應(yīng)的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依賴(lài)性天冬氨酸定向蛋白酶）是一類(lèi)蛋白酶家族，其功能與凋亡（程序性細(xì)胞死亡），壞死和發(fā)燒（炎癥）的過(guò)程密切相關(guān)。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它們是為細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)。多種受體，例如TNF-α 受體，F(xiàn)asL受體，TLR和死亡受體，以及Bcl-2和凋亡抑制劑（IAP）蛋白家族參與并調(diào)節(jié)該caspase依賴(lài)性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號(hào)（外部或內(nèi)在）刺激被激活，即會(huì)參與執(zhí)行下游蛋白底物的水解作用，并觸發(fā)一系列事件，導(dǎo)致細(xì)胞分解，死亡，吞噬作用和細(xì)胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物學(xué)功能等共性主要可分為三大類(lèi)：第一類(lèi)由具有長(zhǎng)胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的“炎癥”胱天蛋白酶組成，他們對(duì)P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類(lèi)由具有短的前體結(jié)構(gòu)域的“細(xì)胞凋亡效應(yīng)”胱天蛋白酶組成，而第三類(lèi)由具有長(zhǎng)的前提結(jié)構(gòu)域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發(fā)劑”胱天蛋白酶組成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分類(lèi)：

       啟動(dòng)器Caspase和效應(yīng)器Caspase酶

      根據(jù)其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用，胱天蛋白酶可分為兩類(lèi)：?jiǎn)?dòng)器和效應(yīng)器Caspase酶。啟動(dòng)器和效應(yīng)器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點(diǎn)，Caspase酶的識(shí)別位

      凋亡啟動(dòng)器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以啟動(dòng)caspase激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8對(duì)于形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效應(yīng)子Caspase（例如Caspase 3）并介導(dǎo)線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對(duì)IETD肽序列具有相對(duì)較高的底物選擇性。凋亡效應(yīng)胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7雖然不負(fù)責(zé)啟動(dòng)級(jí)聯(lián)途徑，但是當(dāng)被激活時(shí)，它們?cè)诩?jí)聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是關(guān)鍵效應(yīng)器，因?yàn)樗糯罅藖?lái)自啟動(dòng)器Caspase的信號(hào)，使用對(duì)Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對(duì)活化的Caspase-3進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制劑

      Caspase底物和抑制劑由兩個(gè)關(guān)鍵成分組成：Caspase識(shí)別序列和信號(hào)產(chǎn)生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識(shí)別序列不同，一般由三個(gè)或四個(gè)氨基酸組成（表2）。Caspase酶識(shí)別序列的N端通常有乙?；ˋc）或碳苯甲氧基（Z）基團(tuán)修飾，以增強(qiáng)膜的通透性。對(duì)應(yīng)的Caspase識(shí)別特定的肽序列為其酶促反應(yīng)切割位點(diǎn)，釋放產(chǎn)生信號(hào)或抑制信號(hào)的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信號(hào)或顏色強(qiáng)度與蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的顯色底物

      Caspase的顯色底物是有Caspase識(shí)別序列及生色基團(tuán)組成，常見(jiàn)的生色團(tuán)有pNA（對(duì)硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)在405 nm處進(jìn)行光密度檢測(cè)。

       表3. Caspase的顯色底物

       Caspase的熒光底物

      Caspase的熒光底物的結(jié)構(gòu)包含與半胱天冬酶識(shí)別相關(guān)的熒光團(tuán)，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于兩步裂解過(guò)程，其動(dòng)態(tài)范圍更窄。 建議將R110標(biāo)記的Caspase底物用于終點(diǎn)法測(cè)定，而將AMC和AFC標(biāo)記的 Caspase底物用于動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

      圖.從左到右，分別是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激發(fā)和發(fā)射光譜。

       表4.熒光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波長(zhǎng)處的摩爾消光系數(shù)（單位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率。

       Caspase抑制劑

      Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點(diǎn)結(jié)合并形成可逆或不可逆的連接，通常，Caspase抑制劑的結(jié)構(gòu)由Caspase識(shí)別序列，諸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能團(tuán)組成。具有醛官能團(tuán)的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的，而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細(xì)胞毒性作用，因此，它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制劑

多肽熒光標(biāo)記由于沒(méi)有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。因此，目前在生物學(xué)研究中多肽熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，多肽熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對(duì)于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來(lái)形成熒光素，通常會(huì)伴有最后一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)間隔器如氨基己酸，或者是通過(guò)非酸性環(huán)境將目的多肽從樹(shù)脂上切下來(lái)時(shí)，這種情況可避免在切割的過(guò)程中被TFA切割掉。
        人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開(kāi)發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        專(zhuān)肽生物能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。
 

下面是一些常見(jiàn)的多肽修飾熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)：




FITC標(biāo)記
 

      FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過(guò)兩種方式將FITC標(biāo)記于多肽 上：(1) 將FITC標(biāo)記于賴(lài)氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護(hù)的鳥(niǎo)氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基 上；(2) 將FITC標(biāo)記于多肽N端氨基。

      當(dāng)在N端標(biāo)記時(shí)，建議在最后一個(gè)氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入 烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC 的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來(lái)形成熒光素，通常會(huì)伴有最后一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)間隔器 如氨基己酸，或者是通過(guò)非酸性環(huán)境將目的肽從樹(shù)脂上切下來(lái)時(shí)，這種情況可避免?？臻g位阻 被認(rèn)為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標(biāo)記的多肽上。

普通熒光修飾

通過(guò)Lys側(cè)鏈氨基連接的熒光修飾

專(zhuān)肽常做的熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)?？晒﹨⒖歼x擇：
 

Basak, S. et al. Biochem. J. 380, 505 (2004).