摘要:

本文旨在構(gòu)建穿膜肽 R8 (RRRRRRRR) 和 pH 敏感型 PEG (聚乙二醇, polyethylene glycols) 共修飾的脂質(zhì)體 (R8 peptide and pH sensitive PEG co-modified liposomes, Cl-Lip) 用于乳腺癌的靶向藥物傳遞。通過卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2K-R8 和PEG5K-Hz-PE (pH 敏感型 PEG) 為材料制備共修飾脂質(zhì)體, 對其粒徑和 zeta 電位進(jìn)行表征。采用 4T1 細(xì)胞考察不同預(yù)孵育條件下細(xì)胞對 Cl-Lip 的攝取。同時(shí)對其入胞途徑、溶酶體逃逸能力及腫瘤球穿透能力進(jìn)行考察。結(jié)果表明, Cl-Lip 粒徑為 (110.4 ±5.2) nm, PDI 為 0.207 ±0.039, zeta 電位為 (−3.46 ±0.05) mV。體外實(shí)驗(yàn)證明, Cl-Lip 具有良好的血清穩(wěn)定性。在不同的預(yù)孵育時(shí)間點(diǎn), 4T1 細(xì)胞對 Cl-Lip 的攝取均呈 pH 依賴性, 在 pH 6.0 條件下的攝取均高于 pH 7.4 條件下的攝取。Cl-Lip 的入胞機(jī)制主要為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和能量依賴型的內(nèi)吞途徑。在 pH 6.0 條件下, Cl-Lip 具有較強(qiáng)的溶酶體逃逸能力和腫瘤球穿透能力。這些結(jié)果表明, 共修飾脂質(zhì)體具有較好的 pH 響應(yīng)性, 是一種潛在的靶向藥物傳遞系統(tǒng)。

最新研究結(jié)果表明, 乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性健康的“頭號殺手”[1]。與其他癌癥相比, 乳腺癌的發(fā)病越來越趨于年輕化。目前乳腺癌的臨床治療手段主要是保守治療和乳房切除術(shù)[2]。其中, 化療仍然是治療乳腺癌的一種主要手段。如何將化療藥物有效地遞送到腫瘤部位是眾多研究關(guān)注的重點(diǎn)[3]。
由于腫瘤組織內(nèi)部血管壁間隙較寬, 結(jié)構(gòu)不完整, 淋巴回流缺失, 使得大分子物質(zhì)和納米給藥系統(tǒng)在腫瘤部位具有較強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng) (enhanced permeability and retention effect, EPR effect)[4]。為此, 研究人員利用腫瘤組織的這一特點(diǎn)將藥物包裹在納米載體中, 通過EPR效應(yīng), 將藥物有效地靶向腫瘤部位發(fā)揮治療作用[5, 6]。

在眾多納米給藥系統(tǒng)中, 脂質(zhì)體具有良好的生物相容性和靶向性, 同時(shí)可以降低所包載藥物的毒性[7]。聚乙二醇 (polyethylene glycols, PEG) 可以顯著延長藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間, PEG 修飾的脂質(zhì)體被廣泛應(yīng)用在納米給藥系統(tǒng)的構(gòu)建中[8]。但是, 當(dāng)PEG 修飾的脂質(zhì)體到達(dá)腫瘤部位后, PEG 較弱的穿透能力會限制脂質(zhì)體入胞進(jìn)一步發(fā)揮作用[9]。

穿膜肽可以高效的介導(dǎo)蛋白、核酸和納米給藥 系統(tǒng)入胞, 典型的穿膜肽包括 TAT (AYGRKKRRQR RR)[10]和 R8 (RRRRRRRR)[11]。然而, 穿膜肽通常都缺乏組織選擇性, 能夠穿透所有細(xì)胞膜, 將納米給藥系統(tǒng)遞送到腫瘤部位的同時(shí)還會將其遞送到其他臟器[12]。另外, 由于穿膜肽 TAT 和 R8 均帶有正電荷, 在血液循環(huán)中會與血漿蛋白結(jié)合, 降低其體內(nèi)穩(wěn)定性[13]。這些缺點(diǎn)大大限制了穿膜肽的體內(nèi)應(yīng)用。鑒于穿膜肽和 PEG 的優(yōu)劣, 為了利用 PEG 的長循環(huán)效應(yīng)和穿膜肽的高效入胞能力, 研究人員構(gòu)建了基于敏感型 PEG 修飾的藥物傳遞系統(tǒng)。這種敏感型 PEG 包括還原敏感型 PEG[14]、酶敏感型 PEG[15]和光敏感型 PEG[16]等。另外, 在實(shí)體瘤中, 腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖分化能力, 腫瘤部位氧供不足, 使得腫瘤組織細(xì)胞外微環(huán)境含有較多乳酸, 其細(xì)胞外的pH 值 (6.5～6.8) 普遍低于正常組織和血液的 pH 值(7.2～7.4)[17, 18]。因此, 也可以利用腫瘤組織這一特殊的微環(huán)境構(gòu)建 pH 敏感型藥物傳遞系統(tǒng)。

本課題設(shè)計(jì)了基于穿膜肽 R8 和 pH 敏感型 PEG的共修飾脂質(zhì)體給藥系統(tǒng) (Cl-Lip)。在血液循環(huán)中該pH 敏感型 PEG 保持穩(wěn)定, 可以屏蔽穿膜肽 R8。當(dāng) 脂質(zhì)體通過 EPR 效應(yīng)靶向到腫瘤部位后, 在腫瘤部位的微酸環(huán)境條件下, 連接 PEG 的化學(xué)鍵水解斷裂, 使得該 pH 敏感型 PEG 斷裂脫離脂質(zhì)體表面, 穿膜肽R8 去屏蔽化, 介導(dǎo)脂質(zhì)體入胞。本文構(gòu)建了此共修飾脂質(zhì)體藥物傳遞系統(tǒng), 利用乳腺癌 4T1 細(xì)胞, 對其體外靶向性包括不同預(yù)孵育條件下的入胞能力、入胞途徑、溶酶體逃逸能力和腫瘤球穿透能力進(jìn)行評價(jià)。

脂質(zhì)體的制備 分別精密稱取 Chole、SPC、DSPE-PEG2K-R8 和 PEG5K-Hz-PE 適量溶于氯仿溶液中, 脂質(zhì)材料按照 Chole、SPC、DSPE-PEG2K-R8 摩爾比為 35∶57∶0.8 精密量取, 制備單純 R8 修飾的 脂質(zhì)體 (R8-Lip)[19]; 按照 Chole、SPC、DSPE-PEG2KR8、PEG5K-Hz-PE 摩爾比為 35∶57∶0.8∶8 精密量 取, 制備共修飾脂質(zhì)體 (Cl-Lip)。進(jìn)一步將所有脂質(zhì)材料加入至 25 mL 茄形瓶中, 在 37 ℃條件下旋蒸 除去氯仿至形成薄膜, 真空干燥過夜。加入 pH 8.0 PBS 溶液 1 mL 放置于搖床中, 37 ℃水化 15 min, 在冰浴條件下探頭超聲 (80 W, 100 s)。所形成的脂質(zhì) 體于 4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩τ?CFPE 標(biāo)記的脂質(zhì) 體, 將適量的 CFPE 氯仿溶液加入至脂質(zhì)材料中共同旋蒸形成薄膜, 使得所形成的脂質(zhì)體中 CFPE 終質(zhì)量濃度為 15 μg·mL−1。

共修飾脂質(zhì)體粒徑和電位的考察 取 Cl-Lip 100 μL, 用純水稀釋至 1 mL, 采用激光粒度儀/zeta 電位分析儀對其粒徑與 zeta 電位進(jìn)行測定。

共修飾脂質(zhì)體體外血清穩(wěn)定性考察 取 Cl-Lip 1 mL 與濾過的胎牛血清 1∶1 (v/v) 混合, 分別于 0.5、1、2、4、8 和 24 h 取 100 μL, 用純水稀釋至 1 mL, 采用激光粒度儀/zeta 電位分析儀對其粒徑進(jìn)行測定。不同預(yù)孵育條件下細(xì)胞對共修飾脂質(zhì)體攝取的考察 定量將所制備的 CFPE 標(biāo)記的 Cl-Lip 與不同pH 條件下 (pH 7.4、pH 6.0) 的 1640 培養(yǎng)基混合使得 CFPE 的終質(zhì)量濃度為 2 μg·mL−1。混合液分別在37 ℃下孵育 1 和 2 h 后, 將其 pH 調(diào)至 7.4 備用。
另將 4T1 細(xì)胞接種在 6 孔板內(nèi), 待細(xì)胞匯合度達(dá)到 70%～80%時(shí), 將原培養(yǎng)基吸出后, 加入 Cl-Lip 與培養(yǎng)基的混合液。在 37 ℃、5% CO2 孵箱中孵育 2 h后將培養(yǎng)基吸出, 用 PBS 漂洗 3 次, 胰酶消化, 離心后用 0.4 mL PBS 重懸細(xì)胞, 采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞對不同預(yù)孵育條件下 Cl-Lip 的攝取強(qiáng)度。

共修飾脂質(zhì)體的攝取機(jī)制考察 將細(xì)胞分別加入適量細(xì)胞攝取抑制劑氯丙嗪、多聚賴氨酸、菲氯平、秋水仙素和疊氮鈉, 孵育 30 min 后再將 Cl-Lip 與培養(yǎng)基的混合液加至上述含有 4T1 細(xì)胞的 6 孔板中, 2 h后吸出培養(yǎng)基, 用 PBS 漂洗 3 次, 胰酶消化, 離心后用 0.4 mL PBS 重懸細(xì)胞, 采用流式細(xì)胞儀檢測加入不同抑制劑后, 細(xì)胞對 Cl-Lip 攝取的程度。同時(shí), 考察在 4 ℃孵育條件下, 細(xì)胞對 Cl-Lip 的攝取強(qiáng)度。
 

共修飾脂質(zhì)體的溶酶體逃逸能力考察 將Cl-Lip 與培養(yǎng)基的混合液加入至含有 4T1 細(xì)胞的 6孔板中, 2 h后加入Lyso-Tracker 使得其終質(zhì)量濃度為1 μg·mL−1, 與細(xì)胞共孵育 30 min 后, 將培養(yǎng)基吸出, 用 PBS 漂洗 3 次, 4%多聚甲醛固定 30 min, 1 μg·mL−1DAPI 溶液染色 5 min, 采用激光共聚焦觀察 Cl-Lip的溶酶體逃逸能力。

共修飾脂質(zhì)體的腫瘤球穿透能力考察 在 96 孔板中加入 2% 低分子量瓊脂糖凝膠的培養(yǎng)基混懸液100 μL, 待其冷卻形成凝膠。另在每孔中加入細(xì)胞混懸液 (每孔細(xì)胞數(shù)為 8 000 個(gè)), 待其生長 3 天, 形成腫瘤球后備用。將 Cl-Lip 與培養(yǎng)基的混合液加至含有腫瘤球的96 孔板中, 與腫瘤球共孵育 2 h 后, 吸出腫瘤球,用PBS 漂洗 3 次, 4%多聚甲醛固定 30 min 后, 采用激光共聚焦觀察 Cl-Lip 對腫瘤球的穿透能力。數(shù)據(jù)處理 采用 Excel 2013 軟件將數(shù)據(jù)錄入, 求得平均值, 并進(jìn)行雙樣本的 t 檢驗(yàn)及方差分析, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 x ±s 表示。

結(jié)果
1 共修飾脂質(zhì)體的粒徑和電位
為了使所構(gòu)建的共修飾脂質(zhì)體 Cl-Lip 可有效地遞送到腫瘤部位, 首先對其粒徑和電位進(jìn)行測定。由表 1和圖 1可見, R8-Lip 的粒徑為 (98.6 ±3.6) nm, PDI為 0.267±0.148; Cl-Lip 的粒徑為 (110.4±5.2) nm, PDI為 0.207 ±0.039, 表明 R8-Lip 和 Cl-Lip 具有良好均一性。
R8-Lip 的 zeta 電位為 (0.56±0.08) mV, Cl-Lip 的zeta 電位為 (−3.46 ±0.05) mV, 結(jié)果表明, 修飾 pH 敏感型的 PEG 后, Cl-Lip 略帶負(fù)電, pH 敏感的 PEG 可以完全屏蔽穿膜肽 R8 的正電荷。

2 共修飾脂質(zhì)體的體外血清穩(wěn)定性
為了模擬體內(nèi)環(huán)境, 考察共修飾脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)的血清穩(wěn)定性, 本課題將脂質(zhì)體與胎牛血清混合孵育, 并在不同時(shí)間點(diǎn)對其粒徑進(jìn)行測定, 考察其血清穩(wěn)定性。由圖 2 可見, Cl-Lip 在不同的時(shí)間點(diǎn), 粒徑均在 110 nm 左右, 且保持穩(wěn)定, 說明該共修飾脂質(zhì)體具有良好的血清穩(wěn)定性。

3 不同預(yù)孵育條件下細(xì)胞對共修飾脂質(zhì)體的攝取
pH 敏感型 PEG 在不同條件下的水解程度是影 響 Cl-Lip 的入胞能力的重要因素。該 pH 敏感型 PEG在不同 pH 的介質(zhì)中和預(yù)孵育時(shí)間條件下會發(fā)生不同程度的水解使其斷裂, 從而不同程度地暴露穿膜肽R8, 因此考察了 Cl-Lip 在不同的預(yù)孵育條件下 4T1細(xì)胞對 Cl-Lip 的攝取。由圖 3 可見, 在 pH 7.4 預(yù)孵育條件下, 隨著預(yù)孵育時(shí)間的增加, 細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取強(qiáng)度沒有明顯變化, 細(xì)胞對其的攝取強(qiáng)度都很弱; 在 pH 6.0 預(yù)孵育條件下, 隨著預(yù)孵育時(shí)間的增加, 細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取強(qiáng)度顯著性增強(qiáng)。同時(shí), 在 pH 6.0 預(yù)孵育條件下, 細(xì)胞對 Cl-Lip 的攝取強(qiáng)度均高于在 pH 7.4 同等條件下的攝取強(qiáng)度。當(dāng)預(yù)孵育時(shí)間為 1 h 時(shí), 細(xì)胞對 pH 6.0 預(yù)孵育條件下的 Cl-Lip 攝取強(qiáng)度是 pH 7.4 條件下的 2.35 倍; 當(dāng)預(yù)孵育時(shí)間為 2 h時(shí), 細(xì)胞對 pH 6.0 預(yù)孵育條件下的 Cl-Lip 攝取強(qiáng)度是 pH 7.4 條件下的 3.87 倍。此結(jié)果表明, 細(xì)胞對 ClLip 的攝取呈 pH 依賴性和預(yù)孵育時(shí)間依賴性。由于在預(yù)孵育時(shí)間為 2 h 時(shí), 細(xì)胞對 pH 6.0 預(yù)孵育條件下的 Cl-Lip 攝取強(qiáng)度較高, 且與 pH 7.4 條件下的攝取強(qiáng)度對比更為明顯。因此, 本課題采用的預(yù)孵育時(shí)間為 2 h。

4 共修飾脂質(zhì)體的攝取機(jī)制
本課題將不同的攝取途徑抑制劑與細(xì)胞共孵育, 以考察共修飾脂質(zhì)體 Cl-Lip 的入胞機(jī)制。其中氯丙嗪為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑抑制劑, 多聚賴氨酸為電荷依賴型的內(nèi)吞途徑抑制劑, 菲氯平為陷穴蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑抑制劑, 秋水仙素為巨胞飲途徑抑制劑, 疊氮鈉為能量依賴型的內(nèi)吞途徑抑制劑, 4 ℃作為能量依賴型的內(nèi)吞途徑的抑制條件。
不同的攝取抑制劑對 4T1 細(xì)胞的攝取有不同的影響 (圖 4), 在 4 ℃條件下孵育對細(xì)胞攝取的抑制率為 67.3%, 氯丙嗪、多聚賴氨酸、菲氯平、秋水仙素和疊氮鈉對細(xì)胞攝取的抑制率分別為 94.1%、30.5%、34.9%、27.0%和 47.1%。結(jié)果表明, Cl-Lip 可通過多種途徑入胞, 其中主要為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo) (氯丙嗪) 和能量依賴型 (疊氮鈉) 的內(nèi)吞途徑。

5 共修飾脂質(zhì)體的溶酶體逃逸能力
由于溶酶體可以降解入胞后的脂質(zhì)體, 降低治療效果, 因此良好的溶酶體逃逸能力是保障脂質(zhì)體發(fā)揮作用的關(guān)鍵性因素[20]。為此, 本課題將 CFPE 標(biāo)記的 Cl-Lip 與 4T1 細(xì)胞共孵育后, 用 Lyso-Tracker標(biāo)記溶酶體, DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核來考察該脂質(zhì)體的溶酶體逃逸能力。如圖 5 所示, 綠色熒光代表 CFPE 標(biāo)記的脂質(zhì)體, 紅色熒光代表 Lyso-Tracker 標(biāo)記的溶酶體, 藍(lán)色熒光代表 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核。在 pH 7.4 預(yù)孵育條件下, 細(xì)胞對 Cl-Lip 的攝取較弱, 沒有在細(xì)胞內(nèi)及周圍顯示出較強(qiáng)的綠色熒光, 無法判斷當(dāng)其入胞后是否可以與紅色熒光標(biāo)記的溶酶體重合, 沒有表現(xiàn)出在該條件下 Cl-Lip 具有溶酶體逃逸能力。在pH 6.0 預(yù)孵育條件下, 細(xì)胞對 Cl-Lip 的攝取顯著性增強(qiáng)。根據(jù)熒光重疊圖可以看出, 盡管有部分脂質(zhì)體吸附在細(xì)胞膜的表面, 但是在溶酶體 (紅色熒光) 周圍也存在散在的綠色熒光, 說明該部分脂質(zhì)體已攝取入胞, 且細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光沒有與紅色熒光重合, 表明在該條件下 Cl-Lip 入胞后并沒有分布在溶酶體中, 具有較好的溶酶體逃逸能力。以上結(jié)果說明, 在低pH條件下, Cl-Lip 具有較強(qiáng)的入胞能力和溶酶體逃逸能力, 入胞后可以避免溶酶體對其的降解, 為其進(jìn)一步發(fā)揮作用提供保障。

6 共修飾脂質(zhì)體的腫瘤球穿透能力
由于體內(nèi)腫瘤部位組織為多層細(xì)胞, 為了模擬其體內(nèi)微環(huán)境, 本課題考查了 Cl-Lip 對腫瘤球的穿透能力。由圖 6 可見, Cl-Lip 對腫瘤球的穿透能力呈顯著的 pH 依賴性。在 pH 7.4 預(yù)孵育條件下, 在腫瘤球表面僅可以看到較弱的綠色熒光, 而在腫瘤球內(nèi)部 25 μm 時(shí), 已經(jīng)無法觀察到綠色熒光。結(jié)果說明, 在生理?xiàng)l件下 Cl-Lip 對腫瘤球的穿透能力較弱, 僅可以分布在其淺層的腫瘤細(xì)胞, 無法穿透進(jìn)入其深層的細(xì)胞; 在 pH 6.0 預(yù)孵育條件下, Cl-Lip 對腫瘤球的穿透能力顯著性增強(qiáng), 在腫瘤球表面可以看到較強(qiáng)的綠色熒光, 而在腫瘤球內(nèi)部 25 μm 時(shí), 仍然能觀察到綠色熒光, 即使在腫瘤球內(nèi)部 50 μm 時(shí), 仍有較弱的綠色熒光。上述結(jié)果說明, 在體外模擬腫瘤組織的微酸環(huán)境下 Cl-Lip 不僅可以分布腫瘤球淺層的腫瘤細(xì)胞, 也穿透到達(dá)其深層的腫瘤細(xì)胞從而發(fā)揮較好的治療效果。

討論
為了避免穿膜肽的組織選擇性差的缺點(diǎn), 結(jié)合PEG 可以長循環(huán)的優(yōu)點(diǎn), 研究人員通過不同性質(zhì)的化學(xué)鍵合成出各類環(huán)境響應(yīng)型的 PEG, 進(jìn)而將此類PEG 和穿膜肽共同修飾在給藥系統(tǒng)中。付寒等[21]通過將二硫鍵引入 PEG 中, 合成出還原敏感型 PEG, 進(jìn)而構(gòu)建了還原敏感型給藥系統(tǒng)。通過利用谷胱甘肽使給藥系統(tǒng)中的還原敏感型 PEG 在胞外斷裂, 從而介導(dǎo)給藥系統(tǒng)入胞。但是由于腫瘤組織胞外的谷胱 甘肽濃度較低[22], 無法通過胞外自身?xiàng)l件使得此化學(xué)鍵斷裂, 因此往往需要給予外源性谷胱甘肽, 增加了該系統(tǒng)的不便。酶敏感型 PEG 斷裂依賴于其酶濃度[23], 使得給藥系統(tǒng)的應(yīng)用受到限制。光敏感型 PEG需要外源性光照使得 PEG 斷裂, 其應(yīng)用也不廣泛。

由于在大多數(shù)實(shí)體瘤中, 胞外 pH 均較低, 當(dāng)給藥系統(tǒng)靶向至腫瘤部位后, 可以利用腫瘤部位自身環(huán)境使 PEG 中的化學(xué)鍵水解, 使得 PEG 從給藥系統(tǒng)表面脫離, 通過穿膜肽入胞能力的介導(dǎo)給藥系統(tǒng)發(fā)揮作用。與其他類型的 PEG 相比, pH 敏感型 PEG 可以使給藥系統(tǒng)“智能”化, 不需要外源性物質(zhì)或光照, 且能廣泛應(yīng)用。因此, 本課題利用腫瘤部位弱酸性環(huán)境, 同時(shí)選取脂質(zhì)體為給藥系統(tǒng), 構(gòu)建了穿膜肽R8 和 pH 敏感型 PEG 共修飾的脂質(zhì)體。

在共修飾脂質(zhì)體的構(gòu)建中, 本課題將穿膜肽 R8修飾在 PEG 上, 利用 PEG 的親水性, 可以減少穿膜肽被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取[19], 同時(shí)脂質(zhì)體到達(dá)腫瘤部位后, 作為“橋梁”直接與細(xì)胞膜接觸, 增加其介導(dǎo)脂質(zhì)體入胞幾率。另外, 將 R8 通過 PEG 連接在DSPE 上, DSPE-PEG2K-R8 作為磷脂材料直接修飾在脂質(zhì)體上, 避免其在血液循環(huán)過程中脫離脂質(zhì)體表面, 增加共修飾脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

通過滲透和 EPR 效應(yīng)到達(dá)腫瘤部位發(fā)揮作用的被動靶向脂質(zhì)體的粒徑范圍為 100～200 nm[24]。實(shí)驗(yàn)表明, 本課題通過薄膜分散法制備的 Cl-Lip 粒徑滿足被動靶向脂質(zhì)體的基本要求。與 R8-Lip 的 zeta 電位相比, Cl-Lip 帶有負(fù)電位, 表明所構(gòu)建脂質(zhì)體在 pH 7.4條件下, 可以較好的屏蔽穿膜肽 R8 的正電荷。R8-Lip的正電荷較低可能是因?yàn)橹|(zhì)體水化過程中選用 pH 8.0 的 PBS, 該 pH 條件下 PBS 的弱堿性使得 R8-Lip的正電荷略有下降。選取 pH 8.0 的 PBS 是為了避免保存過程中 pH 敏感型 PEG 中腙鍵的水解, 降低其對穿膜肽 R8 的屏蔽作用。同時(shí), 體外血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明, 該脂質(zhì)體與血清混合后, 具有良好的穩(wěn)定性, 主要是因?yàn)?PEG 可以屏蔽穿膜肽 R8 的正電荷, 減少血漿蛋白對其結(jié)合并提高穩(wěn)定性, 為進(jìn)一步的體內(nèi)外靶向研究奠定了基礎(chǔ)。

為了驗(yàn)證所構(gòu)建共修飾脂質(zhì)體的 pH 響應(yīng)性, 本課題考察了在不同的 pH 預(yù)孵育條件下細(xì)胞對共修飾脂質(zhì)體的攝取。結(jié)果表明, 在 pH 6.0 條件下, 細(xì)胞對Cl-Lip 的攝取顯著高于 pH 7.4 條件下的攝取, 說明在pH 7.4 條件下穿膜肽 R8 被 pH 敏感型 PEG 屏蔽, 當(dāng)pH 降低后, pH 敏感型 PEG 水解暴露穿膜肽 R8, 使其介導(dǎo)入胞。因此, Cl-Lip 具有良好的 pH 響應(yīng)性。

穿膜肽介導(dǎo)的脂質(zhì)體入胞有多種途徑, 包括能量依賴型的內(nèi)吞途徑、電荷依賴型的內(nèi)吞途徑、巨胞飲途徑、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和陷穴蛋白介導(dǎo) 的內(nèi)吞途徑[25]。為了考察 Cl-Lip 以何種途徑入胞, 本課題考察了其內(nèi)吞途徑。結(jié)果表明, Cl-Lip 的主要入蛋介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和能量依賴型的內(nèi)吞途徑。有相關(guān)報(bào)道[13]表明 R8-Lip 的主要入胞途徑為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑與巨胞飲途徑。然而, 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Cl-Lip 的入胞途徑與 R8-Lip 的入胞途徑略有差異, 其可能是因?yàn)槿跛嵝詶l件下盡管大部分 pH 敏感型 PEG 斷裂, 但是殘存在脂質(zhì)體表面的PEG5K-Hz-PE 會影響脂質(zhì)體的入胞途徑。

另外, 研究表明, 富含精氨酸穿膜肽修飾的納米粒具有較強(qiáng)的溶酶體逃逸能力[26]。在 pH 7.4 條件下, 穿膜肽 R8 被 pH 敏感型 PEG 屏蔽, 無法介導(dǎo)其入胞, 因此細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光較弱, 無法考察其溶酶體逃逸能力的強(qiáng)弱; 在 pH 6.0 條件下, 當(dāng)穿膜肽R8 暴露后, Cl-Lip 在穿膜肽的介導(dǎo)下入胞, 因此在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光較強(qiáng), 同時(shí)其入胞后表現(xiàn)出良好的溶酶體逃逸能力, 進(jìn)而可以避免溶酶體對其降解, 保障其治療作用的發(fā)揮。部分脂質(zhì)體分布在細(xì)胞膜表面可能是因?yàn)閹в姓姷拇┠る?R8 暴露后會吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞膜上。為了模擬體內(nèi)腫瘤組織環(huán)境, 本課題構(gòu)建了腫瘤球, 并考察共修飾脂質(zhì)體的腫瘤球穿透能力。結(jié)果表明, 在低pH條件下, 由于穿膜肽R8的暴露, Cl-Lip吸附在腫瘤球表面, 同時(shí)在穿膜肽 R8 的介導(dǎo)下可以穿透進(jìn)入深層的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用。說明 Cl-Lip 在體內(nèi)弱酸環(huán)境下可以穿透進(jìn)入深層腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用。

本研究初步證明了穿膜肽 R8 和 pH 敏感型 PEG共修飾的脂質(zhì)體具有良好的 pH 響應(yīng)性, 在腫瘤組織微酸性環(huán)境下具有較強(qiáng)的入胞能力, 良好的溶酶體逃逸能力和較強(qiáng)的腫瘤球穿透能力, 是一種潛在的靶向藥物傳遞系統(tǒng)。

最后 ：

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