引言
在腫瘤的臨床治療中化療和放療是常見的兩種手段。在傳統(tǒng)的化療中，常用的抗腫瘤藥物因其細胞選擇性差、不良反應強給患者帶來了極大的痛苦。因此研發(fā)新型的具有靶向選擇性的抗腫瘤藥物顯得極為迫切。
穿膜肽是由5~30個氨基酸殘基組成的具有穿透細胞膜的藥物載體。穿膜肽在穿透細胞膜的同時還可介導siRNA[1]、核酸[2-3]、小分子藥物[4]、蛋白質(zhì)或其他多肽[5-6]等進入細胞。相比其他載體而言，穿膜肽具有高效低毒等特點[7]。

1、 穿膜肽的分類
穿膜肽有多種多樣的分類方式，但是根據(jù)多肽的物理化學性質(zhì)，穿膜肽主要可以分為三類：陽離子、兩親性以及疏水性穿膜肽。
1.1 陽離子穿膜肽
陽離子穿膜肽是一些帶有較高的正電荷和少數(shù)酸性氨基酸的多肽。第一條被發(fā)現(xiàn)的穿膜肽Tat（RKKKRRQRRR）是由Green等[8]從HIV-1蛋白中分離出來的，屬于典型的陽離子穿膜肽。陽離子在腫瘤治療研究中，將傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物與具有靶向性的穿膜肽載藥系統(tǒng)連接，用了穿膜肽衍生物的靶向選擇性，既降低了傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的不良反應，又提高了藥物的利用率。對于治療腫瘤疾病和降低患者痛苦，都有極大的現(xiàn)實意義。因此，腫瘤靶向穿膜肽衍生物的設(shè)計和功能研究越來越受到重視，他在藥物遞送系統(tǒng)中可能扮演的重要角色也為研究者們所看好。穿膜肽的正電荷一般由Arg和Lys來提供。有學者對多聚精氨酸進行研究發(fā)現(xiàn)，八聚精氨酸是能被細胞攝取的最短的序列，并隨著精氨酸個數(shù)的增加，細胞攝取效率顯著增強[9]。相比較而言，多聚賴氨酸的穿膜能力要弱很多[9]。對此，學者們提出，陽離子多肽至少帶有八個正電荷才能有效地穿透細胞膜。

陽離子穿膜肽被認為是進入細胞而不會影響細胞生理功能的特洛伊木馬載體[8]。研究表明，陽離子穿膜肽會引起廣泛的不良反應，包括破壞細胞膜穩(wěn)定性，甚至導致細胞死亡。典型的陽離子穿膜肽有R9[9]、Tat[10]、Protamine1、Penetratin[11]。

1.2 兩親性穿膜肽

兩親性穿膜肽的兩親性特征主要表現(xiàn)在其一級和二級結(jié)構(gòu)中。一級結(jié)構(gòu)兩親性穿膜肽具有親水性的N端和疏水性的C端[12]。研究較多的一級結(jié)構(gòu)兩親性穿膜肽主要是將靶向細胞膜的疏水性區(qū)域與核定位序列NLS通過一個連接子WSQ共價連接得到的[13]。例如，MPG[（GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV）和PEP-1[15]均在來源于病毒SV40的核定位序列（PKKRKV）的基礎(chǔ)上合成。MPG的疏水區(qū)來源于HIV的gp41，而Pep-1與一段富含色氨酸的序列相連，均與細胞膜有很強的親和性。還有一些一級結(jié)構(gòu)兩親性穿膜肽主要從天然蛋白質(zhì)中分離出來，例如：pVEC[16]、ARF(1-22)[17]、BPrPr（1-28）[18]。而二級結(jié)構(gòu)兩親性穿膜肽的兩親性由分子特定的構(gòu)象產(chǎn)生。二級兩親性α-螺旋穿膜肽的一面有很強的疏水性，另一面可能是陽離子的、陰離子的、或極性的氨基酸。β-折疊的兩親性穿膜肽的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)一面是疏水性的，由親水性氨基酸組成的另一面則暴露在溶劑中，如vT5（DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD）[19]。

兩親性穿膜肽中富含脯氨酸的一類穿膜肽引起了學者們的關(guān)注。他們都具有脯氨酸吡咯烷結(jié)構(gòu)[20]，但來源和序列極具多樣性。通過圓二色譜和透色電子顯微鏡的進一步研究發(fā)現(xiàn)，這類穿膜肽都具有很強的自組裝能力。

1.3 疏水性穿膜肽

只含有非極性氨基酸的多肽被劃為疏水性穿膜肽，包括嵌合肽、棕櫚?；嚯腫21]、烯化多肽[22]。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的疏水性穿膜肽有:Kaposi纖維原細胞生長因子（AAVALLPAVLLALLAP）、來源于β3整合素的信號序列（VTVLALGALAGVGVG）[23]等。穿膜肽作為一種生物載體，具有較大的應用前景，與其他的生物大分子材料相比，具有其獨特之處。首先，穿膜肽不僅可以轉(zhuǎn)導多肽和蛋白質(zhì)，也可以將相連的DNA、噬菌體、脂質(zhì)體等多種不同大小的其他物質(zhì)導入細胞；其次，穿膜肽導入的細胞譜廣泛，幾乎能將所攜帶的外源分子
導入所有的哺乳動物細胞中；第三，穿膜肽轉(zhuǎn)導迅速、轉(zhuǎn)導效率高，幾乎可以達到100%。

2 穿膜肽在腫瘤靶向治療中的應用

抗腫瘤藥物由于不能很好地區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞，因而在臨床治療中，表現(xiàn)出較大的不良反應。近幾年，靶向腫瘤細胞或腫瘤血管組織藥物的研發(fā)受到了廣泛關(guān)注，其中包括對穿膜肽的靶向研究。一般穿膜肽在穿透細胞過程中不具備識別能力，這是穿膜肽用于臨床面臨的最大挑戰(zhàn)。為了解決這一難題，科學家們通過對穿膜肽進行設(shè)計和改造，使這些穿膜肽衍生物能夠靶向腫瘤細胞表面特異表達的受體，腫瘤細胞內(nèi)過表達的酶或腫瘤組織特殊的微環(huán)境。上述轉(zhuǎn)運系統(tǒng)到達靶點前，通過掩蓋穿膜肽的穿膜活性，避免穿膜肽在正常組織的非特異性攝取；到達靶點后，穿膜肽完全暴露出來，攜帶藥物進入細胞，使藥物被有效地攝取，提高藥物的靶向治療作用。

理論上，腫瘤細胞在腫瘤治療和成像上是很好的靶標，但由于傳統(tǒng)的化療藥物都是靶向整體的腫瘤細胞，而腫瘤組織的血液灌注比較弱、間質(zhì)壓力較高并且腫瘤組織的血管異常，因此化療藥物很難大量地集中在腫瘤組織中[24-25]，達不到有效的治療濃度。腫瘤細胞及組織也有很多區(qū)別于正常細胞的生理特征，例如，某些腫瘤細胞相較于正常細胞有過表達的受體、腫瘤組織的微酸環(huán)境、腫瘤組織中特有的基質(zhì)金屬蛋白酶。研究者們利用這些生理特征設(shè)計了一系列的穿膜肽藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，攜帶傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物，靶向地進入腫瘤組織，抑制腫瘤細胞的生長。

2.1 利用酸敏感穿膜肽修飾抗腫瘤藥物提高靶向性

腫瘤組織由于代謝快、供氧不足等原因，細胞通過糖酵解提供能量產(chǎn)生大量乳酸，且腫瘤血管不能及時清除，最終導致腫瘤組織微環(huán)境pH值為5.7~7.2，明顯低于正常組織的pH7.4[26]。這種酸性微環(huán)境是提高抗腫瘤藥物選擇性的一個有效靶點。

2.1.1 組氨酸 組氨酸是一種具有緩沖能力的氨基酸，被大量用于酸敏感藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的研究。組氨酸咪唑基團的pKa約為6.5，所以在酸性腫瘤微環(huán)境中能夠質(zhì)子化帶正電荷，而在正常生理環(huán)境下不帶電荷?？紤]到組氨酸的這一特點，研究者們設(shè)計了一系列具有穿透或裂解細胞膜的酸敏感多肽。Zhang等[27]研究了酸敏感穿膜肽TH與熒光素標記后，在不同酸性條件下的穿膜活性以及TH與喜樹堿連接物的抗腫瘤活性。研究結(jié)果表明，TH以及與喜樹堿連接物都表現(xiàn)出很好的酸依賴活性，并且TH的體外和體內(nèi)毒性都明顯降低。如此，既增強喜樹堿的水溶性，提高喜樹堿的抗癌活性，又降低了其對正常組織的毒性，降低臨床應用中對患者的不良反應。Jiang等[28]用酸敏感穿膜肽R6H4與透明質(zhì)酸形成雙功能脂質(zhì)體（HAR6H4-L），以腫瘤組織中的透明質(zhì)酸受體和酸性微環(huán)境為靶點，研究該脂質(zhì)體與抗腫瘤藥物紫杉醇連接（PTX/HA-R6H4-L）后在不同條件下的抗腫瘤活性。實驗結(jié)果顯示，PTX/HA-R6H4-L在pH6.4對肝癌細胞的毒性明顯強于pH7.4。

2.1.2 腙鍵 腙鍵是一個酸敏感的連接子且是比較理想的共價鍵連接體。腙鍵與傳統(tǒng)的酯鍵和酰胺鍵不同，腙鍵對酸性比較敏感、鍵的斷裂不需要溶酶體酶。相對于亞胺鍵來說，腙鍵具有更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可存在于中性和堿性環(huán)境。只有在酸性環(huán)境和高溫催化條件下，腙鍵的轉(zhuǎn)胺效率才
會顯著提高。在生理pH7.4條件下，腙鍵非常穩(wěn)定，當pH降到5~6時，腙鍵迅速裂解釋放出藥物。Sawant等[29]將磷脂酰乙醇胺和PEG通過二硫鍵連接，得到mPEG-HZ-PE，在此連接物中引入了一個酸敏感的腙鍵，再將得到的mPEG-HZ-PE用穿膜肽TAT或生物素修飾，得到一個納米載體。在生理pH條件下，納米載體表面的生物素或TAT被PEG長鏈（酸敏感PEG2000-PE或PEG5000-PE）保護起來，在pH7.5~8.0條件下，被TAT修飾的納米載體幾乎不會穿過NIH/3T3和U-87細胞膜，被細胞內(nèi)化。然而，在pH5.0~6.0條件下孵育15~30 min時，納米載體中的腙鍵斷裂，PEG丟失，裸露出陽離子穿膜肽TAT，該納米載體有效地被細胞內(nèi)化。將抗腫瘤藥物與該載體連接，就能靶向地進入腫瘤組織，從而達到靶向治愈癌癥的目的。以上研究結(jié)果表明，酸敏感穿膜肽與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物連接，不僅可以提高其水溶性，降低其毒性，還能增加其腫瘤組織滲透性，避免產(chǎn)生耐藥性，提高其臨床應用。

2.2 利用靶向穿膜肽修飾抗腫瘤藥物提高抗腫瘤藥物的選擇性

    腫瘤穿透歸巢肽（cell-penetrating homingpeptides, CPHPs）與經(jīng)典的穿膜肽類似，具有穿膜活性，在穿膜的過程中具有細胞特異性[30]。CPHPs與受體識別并結(jié)合，通過內(nèi)吞的方式將所載藥物運輸?shù)桨屑毎?。RGD能夠特異性的識別在腫瘤侵襲過程中表達上調(diào)的αv整合素，RGD具有多種形式。例如：RGD-4C，iRGD和cRGD等。將RGD與誘導凋亡多肽或抗腫瘤藥物連接，應用于關(guān)節(jié)炎和多種癌癥的治療。iRGD（Cys-ArgGly-Asp-Lys/Arg-Gly-Pro-Asp/Glu-Cys[CRGDK/RGPD/EC]）據(jù)報道能夠增強多血管及組織的特異性，且這種增加具有腫瘤特異性和神經(jīng)氈蛋白（NRP-1）依賴性。由于iRGD具有腫瘤靶向性和腫瘤穿透性，而某些腫瘤會過度表達αv蛋白受體和NRP-1，Yu等[31]將iRGD作為靶向配體，空間穩(wěn)定脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（SSL），攜帶阿霉素形成了一個iRGD修飾的脂質(zhì)體藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（iRGDSSL-DOX），測定其對αv蛋白受體和NRP-1過度表達的B16-F10細胞構(gòu)成了裸鼠腫瘤細胞模型的抑瘤率。實驗結(jié)果表明，iRGD-SSL-DOX與對照組SSL-DOX相較，明顯抑制B16-F10腫瘤細胞的生長。且從小動物成像結(jié)果來看，前者高度集中在腫瘤區(qū)域，提高了阿霉素的安全性以及治療效果。上述具有細胞特異性的CPHPs還有TCP-1、CAP等等。

除了上述CPHPs，還有一類與其相似的靶向肽：腫瘤歸巢肽（homing peptides, HPs）。腫瘤歸巢肽與CPHPs類似，同樣具有識別腫瘤細胞或組織中受體的功能，但沒有穿膜作用。因此，研究者們將腫瘤歸巢肽與經(jīng)典的穿膜肽相連，形成靶向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。Mäe等[32]研究了線性乳腺腫瘤歸巢肽CREKA與穿膜肽pVEC相連形成的嵌合肽與烷化劑苯丁酸氮芥對MDA-MB-231腫瘤細胞的殺傷作用。實驗結(jié)果表明，該共軛物的體外抗腫瘤效果明顯強于苯丁酸氮芥單獨用藥。說明CREKApVEC是合適的細胞內(nèi)靶向轉(zhuǎn)運體。

大量研究結(jié)果表明，CPHPs和HPs能夠識別組織中特異性的生物標志，進入特異的組織或器官中。這些歸巢肽不僅可以提高細胞攝取率且能將藥物分子、成像制劑、納米粒子、寡核苷酸和脂質(zhì)體靶向轉(zhuǎn)運到各種組織包括腫瘤。

2.3 穿膜肽基于腫瘤細胞表面特異性受體實現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)運

腫瘤細胞表面會表達大量的受體，一些過表達的受體在腫瘤的生長、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移中介導著重要的生理功能。研究者們利用腫瘤組織中有別于正常組織中的受體設(shè)計一系列抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，使抗腫瘤藥物富集在病灶，達到高效治療腫瘤的目的。

2.3.1 葉酸受體 葉酸對細胞表面的葉酸受體有高度特異性和親和性。葉酸受體是一種糖基化磷脂酰肌醇連接的膜糖蛋白，在90%卵巢癌和上皮細胞癌中選擇性的過度表達[33]，包括HeLa細胞。Kang等[34]研究葉酸和穿膜肽PEP-1構(gòu)成的雙配體修飾脂質(zhì)體（FP-Lipo）在HeLa細胞和葉酸受體表達較少的HacaT細胞的穿膜肽能力。在研究中同時合成了葉酸修飾的脂質(zhì)體（F-Lipo）、Pep-1修飾的脂質(zhì)體（P-Lipo）。研究結(jié)果表明，P-Lipo在這兩種細胞中沒有選擇性。而F-Lipo在HeLa細胞中熒光強度比HacaT細胞中強，具有一定的細胞選擇性，但細胞穿透能力較P-Lipo弱。FP-Lipo在HeLa細胞中的熒光強度是HacaT中的3倍， FP-Lipo與其他兩種脂質(zhì)體比較，具有更強的穿膜能力和靶向性。利用此種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，就能將抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運到腫瘤細胞中，高效、選擇性的殺死腫瘤細胞，降低藥物的不良反應。

2.3.2 ErBb2 ErBb2是一種表皮生長因子受體，在25%~35%乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌中過度表達。Tan等[35]將由Tat衍生的穿膜肽與抗HER-2/神經(jīng)鞘肽結(jié)合，形成AHNP。為了設(shè)計一個能夠?qū)⑺幬锾禺愋赞D(zhuǎn)運到ErBb2過度表達的腫瘤細胞的多肽載體，他們研究了具有非選擇性穿膜活性的TAT精氨酸殘基部分P3（YGRKKRRQR）與AHNP形成的多肽載體與STAT3抑制肽的絡(luò)合物對乳腺癌的抑制效果。通過免疫組織染色研究證明，STAT3能夠激活50%的乳腺癌并且預后不良，STAT3抑制肽（STAT3BP）能夠抑制STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活性。將STAT3BP與AHNP結(jié)合形成的絡(luò)合物能夠?qū)TAT3BP特異性轉(zhuǎn)運到ErBb2過度表達的乳腺癌細胞中，達到破壞STAT3活性、誘導細胞凋亡和抑制體內(nèi)腫瘤生長的作用，與此同時，STAT3BP的活性并沒因與AHNP結(jié)合而受到影響。該絡(luò)合物表現(xiàn)出更強的抑制ErBb2過度表達的435.eB腫瘤細胞，增大其凋亡比例。而ErBb2表達相對較少的MDAMB-435對藥物的敏感度則較差。

2.4 利用腫瘤組織特有的基質(zhì)金屬蛋白酶實現(xiàn)靶向傳送

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是一組結(jié)構(gòu)上具有極大同源性，能夠降解細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的內(nèi)肽酶的總稱。因含有金屬離子（鋅、鈣）而得名。腫瘤分泌MMPs降解ECM，破壞周圍間質(zhì)成分和重整細胞之間的黏附關(guān)系，促進新生血管的生成，進而腫瘤細胞便沿著破壞的ECM向周圍組織浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移。由于基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的MMP-2和（或）MMP-9已被證實在多種惡性腫瘤中高表達，在正常組織中表達微弱，且其表達與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移
潛力相關(guān)，成為設(shè)計靶向抗腫瘤藥物的靶點。

2004年，第一個利用穿膜肽設(shè)計的能夠被激活的靶向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)被報道。Jiang等[36]用可以被MMP-2切斷的PLGLAG將帶正電荷的穿膜肽（九聚精氨酸）和帶負電荷的八聚谷氨酸連接形成了一個嵌合體。這個嵌合體中，九聚精氨酸的正電荷與八聚谷氨酸的負電荷通過點和相互作用力形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。以6 μM的濃度給藥，發(fā)現(xiàn)由于循環(huán)系統(tǒng)中MMP-2的濃度較低，連接子PLGLAG沒有發(fā)生斷裂。九聚精氨酸的正電荷被八聚谷氨酸的負電荷屏蔽，陽離子穿膜肽不能與血管中帶負電荷的細胞結(jié)合，避免正常組織中的非特異性結(jié)合。而在腫瘤組織周圍，由于腫瘤細胞的分泌，MMP-2的濃度明顯增加。該嵌合體的連接子被切斷，帶正電荷和負電荷的離子部分游離出來，穿膜肽的穿膜能力得以恢復，進入腫瘤細胞中。利用這種方法，穿膜肽就能被腫瘤細胞選擇性的攝取，由于穿膜肽攜帶的藥物都共價連接在穿膜肽上，因此可以通過嵌合體的濃度來調(diào)節(jié)給藥濃度，達到靶向治療腫瘤的目的。

3 穿膜肽的臨床應用

穿膜肽在攜帶藥物及其他功能性分子時，由于具有高效低毒特性，受到廣大科學家及醫(yī)務工作者的廣泛關(guān)注，更多地投入到穿膜肽的研究中，促使穿膜肽從基礎(chǔ)研究發(fā)展到了臨床，造福人類。

西侖吉肽[30]是一種靶向αvβ3和αvβ5整合素的腫瘤血管生成抑制多肽藥物，是環(huán)狀RGD五肽鹽，也是第一個進入臨床實驗的CPHP。在臨床Ⅰ期和Ⅱ期試驗中，西侖吉肽與放射療法和替莫唑胺聯(lián)合應用于惡性膠質(zhì)瘤中的晚期實體瘤、復發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤和難以治愈的腦瘤患者。研究結(jié)果表明，西侖吉肽能夠?qū)?7%的復發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤患者的生命延長1年，22%的患者延長2年；與其他的藥物相比，效果較好。

由MolMed SpA公司研制的NGR-hTNF是將N G R多 肽 （C N G R C） 與 人 腫 瘤 壞 死 因 子（TNF-α）的N末端共軛結(jié)合所得，能選擇性地識別氨基肽酶N（CD13）特異性亞型，而CD13僅在血管生成組織中表達，在正常上皮組織中未見。因此，該藥NGR多肽部分通過選擇性靶向血管發(fā)生作用，TNF則在靶點釋放，破壞腫瘤的血流供應，從而使腫瘤縮小。多項Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗均顯示：當NGR-hTNF單獨或與化療藥物聯(lián)用于惡性胸膜間皮瘤、直腸癌、肝癌以及非小細胞肺癌等多種進展期或轉(zhuǎn)移性實體瘤時，均表現(xiàn)出良好抗腫瘤活性，且患者對其有良好的耐受性。

4 結(jié)語
穿膜肽由于能夠攜帶小分子藥物、核酸、多肽等進入細胞，近年來在藥學及治療學領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。但由于缺乏細胞選擇性、穩(wěn)定性差、生物利用度低而限制了穿膜肽的臨床應用?？蒲袑W者們利用非天然氨基酸提高其穩(wěn)定性，用透明質(zhì)酸等保護穿膜肽在到達靶點前被降解提高其生物利用度，根據(jù)腫瘤特異性對穿膜肽加以修飾；將靶向肽與經(jīng)典的穿膜肽相連，賦予穿膜肽腫瘤靶向性，大大提高了穿膜肽在腫瘤治療方面的應用。目前穿膜肽及其衍生物在臨床上的應用還很少，因此，降低穿膜肽這種載體的不良反應，提高其體內(nèi)穩(wěn)定性，將會有很好的發(fā)展前景。