摘要：活性多肽可以參與生命機(jī)體的多種生理活動，對促進(jìn)人體健康發(fā)揮著重要的作用，如降血壓、降血糖、降血脂和抗癌等，其創(chuàng)制技術(shù)也逐漸成為重要的研究和應(yīng)用轉(zhuǎn)化方向。本綜述旨在總結(jié)天然活性多肽的發(fā)掘策略和生產(chǎn)技術(shù)的研究進(jìn)展。目前，天然活性多肽的發(fā)掘與生產(chǎn)技術(shù)主要包括自上而下和自下而上兩種方法，其中自上而下方法在多肽發(fā)掘方面主要為直接提取鑒定法，在生產(chǎn)技術(shù)方面主要包括直接提取法、酶解法和微生物發(fā)酵法；自下而上方法在多肽發(fā)掘方面包括天然活性多肽改造和數(shù)據(jù)庫發(fā)掘方法，在生產(chǎn)技術(shù)方面主要方法包括化學(xué)合成法、酶合成法、基因重組表達(dá)法和無細(xì)胞合成法。自上而下的天然多肽制備與功能驗(yàn)證方法存在步驟煩瑣、耗費(fèi)時間長、功能不確定性大、實(shí)驗(yàn)與生產(chǎn)成本高以及質(zhì)量控制難度大等問題；而自下而上的活性多肽合成與功能驗(yàn)證方法適合多肽藥物的開發(fā)，而難以用于功能食品。隨著測序和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，人們更容易從分子水平獲取物種蛋白組信息。以此蛋白組信息為根據(jù)，將自上而下和自下而上兩種方法結(jié)合，可以克服單獨(dú)使用這兩種方法存在的問題，從而為快速開發(fā)和生產(chǎn)天然活性多肽提供新的策略。

隨著社會生產(chǎn)力的發(fā)展，人們的生活水平不斷提升，健康意識不斷增強(qiáng)，對健康產(chǎn)品的需求也在不斷增長。目前，全球各類疾病患者占總?cè)丝跀?shù)量的20%，亞健康人群占人口總數(shù)的75%以上，而健康人群總量不足5%的現(xiàn)狀導(dǎo)致社會醫(yī)療支出負(fù)擔(dān)持續(xù)加重，并成為日益嚴(yán)重的社會性問題[1]。因此，如何改善亞健康狀態(tài)，并使健康狀態(tài)得到持續(xù)維持，成為國家和社會關(guān)注的重點(diǎn)。而相較于傳統(tǒng)的疾病治療觀念，預(yù)防疾病的發(fā)生即“治未病”，不失為一種更好的健康維持手段。因此學(xué)者們提出了“大健康”這一理念。在“大健康”理念下，健康產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)多元化發(fā)展態(tài)勢[2]。

我國是農(nóng)業(yè)大國，源于農(nóng)業(yè)資源的天然蛋白質(zhì)種類豐富，總量巨大。但目前天然蛋白質(zhì)資源多用于生產(chǎn)動物飼料和食品蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑等附加值較低的產(chǎn)品，在蛋白質(zhì)的精細(xì)加工與高值化綜合利用方面還有很大的發(fā)展空間。天然生物活性多肽(Natural bioactive peptides)是一類源自天然蛋白質(zhì)的生物資源，組成多肽的氨基酸數(shù)量一般在2–50個之間[3]。生物活性多肽在生命機(jī)體中可發(fā)揮重要的生理調(diào)節(jié)作用，如抗菌抑菌、降血糖、降血壓、降膽固醇、抗氧化、抗肥胖、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、與礦物元素結(jié)合等生理功能[4]。活性多肽分子量較小，種類豐富，在人體內(nèi)以微量存在，具有細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)容易、吸收利用度高、半衰期短、毒性和免疫原性低、生物活性多樣等特點(diǎn)，因此成為21世紀(jì)人類健康保健品的新寵兒。目前，天然活性多肽的研發(fā)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用發(fā)展迅速。根據(jù)Biopep數(shù)據(jù)庫[5]中的數(shù)據(jù)，活性多肽數(shù)量已達(dá)4 000余種。然而目前，挖掘具有保健功能的活性多肽的技術(shù)仍然比較落后[6]，難以滿足健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求。若能夠發(fā)展高效的天然活性多肽創(chuàng)制技術(shù)，將大大提高蛋白質(zhì)的高值化利用能力，極大地促進(jìn)天然蛋白質(zhì)資源精深加工的技術(shù)進(jìn)步及產(chǎn)業(yè)鏈延伸。

盡管活性多肽具有較高的醫(yī)藥健康功效和經(jīng)濟(jì)價值，但其現(xiàn)有的發(fā)掘和生產(chǎn)技術(shù)方法均存在一些問題，如多肽發(fā)掘方法周期長、研發(fā)成本高；而多肽生產(chǎn)方法如天然活性多肽提取和發(fā)酵制備方法受限于原料或菌群組成的不穩(wěn)定性，造成產(chǎn)品的質(zhì)控難度大。然而，目前尚缺乏系統(tǒng)總結(jié)天然活性多肽發(fā)掘和生產(chǎn)技術(shù)的綜述性文章。因此，本文將從自上而下和自下而上兩個角度，詳細(xì)總結(jié)活性多肽的發(fā)掘和生產(chǎn)方法，分析兩種方法的特點(diǎn)及不足，并提出將自上而下和自下而上兩種方法結(jié)合的思路，為多肽發(fā)掘與生產(chǎn)提供了新策略，進(jìn)而推動新型活性多肽的創(chuàng)制進(jìn)程。

1 天然活性多肽的發(fā)掘

活性多肽的功能是依靠其特定的序列和特殊的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的。因此，如何從復(fù)雜天然生物體系中篩選出具有特定生物學(xué)活性的多肽，是天然活性多肽創(chuàng)制和應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。目前，活性多肽發(fā)現(xiàn)的方法主要包括直接從天然產(chǎn)物中提取鑒定、天然活性多肽改造以及多肽數(shù)據(jù)庫與人工智能挖掘等。

1.1 天然活性多肽的功能序列發(fā)現(xiàn)

1.1.1 天然產(chǎn)物中直接鑒定活性多肽

最直接的活性多肽挖掘方法是使用物理手段從天然生物資源及其酶解產(chǎn)物或發(fā)酵物中分離提取，然后進(jìn)一步挖掘其所具有的生理活性功能；或從天然資源中篩選、分離具有特定功能的生物活性多肽。Ferreira等[7]于1965年從美洲矛頭蝮Bothrops jararaca蛇毒中分離到了具有降血壓作用的替普羅肽(pyroGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile- Pro-Pro)，而Danielle[8]等也于2004年采用兩步液相色譜法及電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法從蛇毒中鑒定了5種新的緩激肽增強(qiáng)肽。DiBianco[9]發(fā)現(xiàn)替普羅肽末端7–9位的Ile-Pro-Pro序列能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin converting enzyme，ACE) 的活性，減少血管緊張素Ⅱ的生成，避免過多的血管收縮從而達(dá)到降血壓的效果。Takano[10-11]團(tuán)隊(duì)也根據(jù)此序列信息，從酸奶中分離到了有ACE抑制活性和體內(nèi)降血壓活性的Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro兩種三肽序列，并解析了其作用機(jī)制。而飲料公司Calpis也將包含Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro兩種三肽的乳酸菌飲品和保健品推向了市場，在受高血壓困擾的中老年人中收獲了廣泛好評。

1.1.2 天然活性多肽改造

對目前已知序列及功能的多肽進(jìn)行改造，可獲得功效更好的新型活性多肽。例如，人體中的胰高血糖素樣肽(GLP-1)[12]具有促進(jìn)胰島素生成和分泌、延遲胃排空、降低食欲以及減少胰高血糖素分泌等作用，是控制血糖和治療Ⅱ型糖尿病的重要生物活性肽。但這種多肽易被內(nèi)源酶二肽基肽酶-4 (DPP-Ⅳ)[13]快速降解，在血液內(nèi)的半衰期僅為10 min。研究者們通過對GLP-1的部分氨基酸替換，獲得了半衰期更長的多肽產(chǎn)品，如艾塞那肽(Exenatide)[14]、利西拉肽(Lixisenatide)[15]和索馬魯肽(Semaglutid)[16]等，其中索馬魯肽的作用周期(半衰期) 可達(dá)1周，成為Ⅱ型糖尿病治療的重要多肽藥物。

1.1.3 多肽數(shù)據(jù)庫與人工智能挖掘活性多肽

基于已有的活性多肽序列與功能數(shù)據(jù)庫，利用自然語言處理(Nature language processing，NLP) 和人工智能方法，生成有功能的未被識別到的多肽也是近年來發(fā)展起來的一種活性多肽挖掘新方法。在多肽的自然語言處理模型中，20種天然氨基酸殘基就像26個英文字母，而每一條由不同氨基酸組成的多肽序列就是一個“單詞”，其對某個疾病和特定受體的功能就是“詞義”。Giguère等[17]使用機(jī)器學(xué)習(xí)方法，通過對Joo等[18]實(shí)驗(yàn)得到的抑菌多肽結(jié)構(gòu)功能庫中的序列生成NLP模型進(jìn)行語義分析，得到了數(shù)條自然界未被識別的且具有較高活性的抑菌多肽。Fang等[19]同樣基于NLP模型，使用深度學(xué)習(xí)算法，從Agrawal[20]的數(shù)據(jù)庫中選取訓(xùn)練集，最終篩選出了具有抗真菌功能的活性多肽。這些研究結(jié)果顯示人工智能在活性多肽挖掘中的應(yīng)用潛力，但該領(lǐng)域的研究仍處于初步發(fā)展階段。

1.2 活性多肽功能評價方法

活性多肽功能主要是通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評價的。任美娟[21]通過體外的抗氧化表征實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)杏鮑菇多肽口服液具有抗氧化功能。孫金沅等[22]通過體外表征發(fā)現(xiàn)白酒酒醅中兩種多肽具有抗氧化和降血壓功能。李繼海[23]通過小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)梅花鹿茸來源的活性多肽能夠提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和機(jī)體免疫功能。戴媛[24]通過大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大豆多肽TTYY使抗氧化酶活性和GSH含量升高，且處理劑量不同改變的效果不同，400 mg TTYY/kg體重的處理劑量效果最佳，說明TTYY減輕了脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷，提高了抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量，增強(qiáng)了大鼠機(jī)體的抗氧化能力。然而，多肽的功能評價通常是活性多肽研發(fā)的決速環(huán)節(jié)，其周期長、成本高、通量低，且細(xì)胞和動物模型結(jié)果難以用于預(yù)測對于人體的作用，未來需要發(fā)展更高效和更具有針對性的功能評價方法。比如Xing等[25]綜述了微流控人源類器官系統(tǒng)能夠更好地模擬人體真實(shí)器官功能，作為新型高通量篩選和表征模型可以提高活性多肽功能挖掘的效率和可靠性。

1.3 活性多肽的構(gòu)效關(guān)系

活性多肽與其靶蛋白的構(gòu)效關(guān)系研究對于挖掘更多的活性多肽以及理解活性多肽結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系具有重要意義。Nongonierma和FitzGerald[26]開發(fā)了一種結(jié)合蛋白質(zhì)覆蓋率和效能指數(shù)的計(jì)算方法，并應(yīng)用了肽段比對策略來研究序列與功能之間的關(guān)系。此外，分子對接[27]模擬方法也已被用于闡明實(shí)驗(yàn)或預(yù)測的多肽序列與生物活性靶標(biāo)蛋白質(zhì)的相互作用。Nongonierma等[28]還發(fā)現(xiàn)，對接三肽分子與DPP-Ⅳ活性位點(diǎn)獲得的Vina分?jǐn)?shù)(預(yù)測的親和力) 與其體外DPP-Ⅳ抑制特性之間并沒有直接相關(guān)性，因此建議研究者應(yīng)建立結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的多維度模型，而不是直接使用對接的親和力高低來選擇目標(biāo)活性多肽。Zhou等[29]使用定量構(gòu)效關(guān)系(Quantitative structure-activity relationship，QSAR)分析方法，并結(jié)合量子力學(xué)/分子力學(xué)分析方法，解析了多肽與ACE酶的復(fù)合物所涉及的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和高能譜，以及模型化ACE與多肽之間的相互作用譜。Acharya等[30]指出，活性多肽與其靶蛋白結(jié)合過程中的動態(tài)構(gòu)象變化對對接計(jì)算結(jié)果也有影響，并提倡建立記錄這些變化的4D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以更好地反映多肽的構(gòu)效關(guān)系。張貴川[31]利用經(jīng)典的z-scales氨基酸描述子，對140種抑制ACE的三肽進(jìn)行了描述，得到關(guān)于IC50的回歸方程從而建立了所有三肽序列對于ACE抑制活性的模型。表 1列舉了部分慢性病相關(guān)蛋白與活性多肽序列的構(gòu)效關(guān)系，并針對這些蛋白總結(jié)出活性多肽的序列規(guī)律。

2 活性多肽的生產(chǎn)方法

現(xiàn)有的活性多肽的生產(chǎn)方法可以分為自上而下與自下而上兩大類。自上而下指從動植物蛋白原料出發(fā)進(jìn)行加工、分離、純化進(jìn)而得到活性多肽的過程，主要包括直接提取法、酶解法、微生物發(fā)酵法等；自下而上指從小分子的氨基酸出發(fā)合成特定多肽序列的過程，主要包括化學(xué)合成法、化學(xué)-酶耦合法、基因工程表達(dá)和無細(xì)胞合成等?；钚远嚯牡纳a(chǎn)方法、篩選和實(shí)際應(yīng)用的關(guān)系如圖 1所示。

2.1 自上而下的活性多肽生產(chǎn)方法

2.1.1 活性多肽直接提取法

直接提取法可基于肽的分子量、電學(xué)性質(zhì)等物理特性，實(shí)現(xiàn)從生物質(zhì)中分離目標(biāo)活性多肽的目的。例如曹伯良[39]開發(fā)了利用超濾、納濾等方式從養(yǎng)殖水中直接提取生物活性多肽的裝置；Preecharram等[40]利用陰離子交換、凝膠過濾和反相高效液相色譜法處理得到了暹羅鱷魚血清中的6種抗菌肽(Hp14、Hp15、Hp17、Hp31、Hp36和Hp51)。直接提取法分離過程取決于天然原料的多肽種類和含量，影響因素多，技術(shù)經(jīng)濟(jì)性不高。因此，從天然資源直接提取活性多肽的方法適于新功能的發(fā)現(xiàn)，但一般難以用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.1.2 蛋白原料的蛋白酶解法

酶解法是利用蛋白酶水解蛋白原料得到目標(biāo)活性多肽的方法。蛋白酶作為天然生物催化劑，不僅能夠水解氨基酸之間的肽鍵，還可以催化其他類型的反應(yīng)，如外消旋醇和羧酸拆分中的酯化和酯交換反應(yīng)，以及中、前手性二醇的立體選擇性?；磻?yīng)。蛋白酶能夠特異地降解蛋白底物，從而生成活性多肽[45]。

目前報道的應(yīng)用于多肽制備的食品工業(yè)用蛋白酶包括堿性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶(Neutrase)、木瓜蛋白酶(Papain)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)、胃蛋白酶(Flavourzyme)、胰蛋白酶(Trypsin)、枯草芽孢桿菌分離蛋白酶(Bacillus subtilis isolated enzymes)、嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin) 等[46-55]。目前，用于食品或功能食品的活性多肽制備必須使用這些食品級蛋白酶。

Arrutia等[56]使用胰蛋白酶水解牛血清白蛋白(BSA) 產(chǎn)生的多肽產(chǎn)物混合物具有ACE抑制作用、DPP-Ⅳ (二肽基肽酶-4) 抑制作用和抗氧化作用。Chang[57]等在胃蛋白酶-胰酶酶解油棕櫚仁得到的水解液(Oil palm kernel hydrolysate, OPKH) 中提取多肽，通過超濾、反相HPLC、半制備HPLC等方法純化OPKH，再采用液相色譜-電噴霧電離/多級質(zhì)譜(LC-ESI-Q-TOF- MS/MS) 和從頭測序相結(jié)合的方法鑒定出3個抗氧化肽VVGGDGDV、VPVTST和LTTLDSE。Lajmi等[58]采用胰蛋白酶對星鯊屬魚類Mustelus mustelus 的膠原蛋白進(jìn)行水解，得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE) 或脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP) 抑制活性的蛋白水解物，且用海藻酸鈉-乳清蛋白分離微球包裹水解產(chǎn)物可提高ACE抑制活性(IC50=0.24 mg/mL)。Mudgil等[59]和Nongonierma等[60-61]以駱駝奶為原料，通過堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶得到同時具有α-淀粉酶(α-amylase)、胰脂肪酶(pancreatic lipase)和DPP-Ⅳ抑制作用的降食欲蛋白水解物，并從中篩選出VPV、VPF、LPVPQ和YPI等抗模擬消化(Simulated gastric and intestinal digestion, SGID) 的活性多肽。

蛋白酶解法生產(chǎn)活性多肽具有高效性、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，然而這一方法最大的挑戰(zhàn)是蛋白酶的選擇。同種原料選擇不同的酶進(jìn)行酶解得到肽譜以及多肽相對含量差別很大。同時由于食品級蛋白酶的純度以及分子特性等產(chǎn)品信息有限，用于天然活性多肽的制備與生產(chǎn)常需要反復(fù)試錯，耗物耗時耗力，對原料質(zhì)量要求高，質(zhì)控難度大。而基于數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列，引入生物信息學(xué)方法或者軟件應(yīng)用等工具對蛋白酶切位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測能夠輔助酶的選擇，對于未來特異性蛋白酶的分子設(shè)計(jì)具有重要參考價值。例如，Yu等[62]以蝦夷盤扇貝Mizuhopecten yessoensis提取出的肌球蛋白(Myosin) 為原料，通過PeptideCutter[63]對水解多肽組成進(jìn)行了預(yù)測, 并篩選出了其中具有抑制ACE活性的7種三肽。

2.1.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)食品級蛋白水解物和活性多肽的有效途徑之一[4]。常見天然原料主要有牛奶蛋白、奶酪、蛋清、魚類、藻類、豆類(黃豆、綠豆)、谷類(小麥、大米、燕麥) 等[64-66]，此外，藜麥、鷹嘴豆、葡萄等[67-68]也曾被使用。目前，歐美地區(qū)從乳制品中發(fā)酵生產(chǎn)生物活性多肽的方法與工藝最為成熟，亞非地區(qū)則更多使用豆類作為發(fā)酵原料。在發(fā)酵過程中常用的微生物主要有乳酸菌Lactococcus、乳桿菌Lactobacillus、嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus、酵母菌Saccharomyces、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[69-71]等。Daliri等[72]利用戊糖小球菌Pediococcus pentosaceus SDL1409在37 ℃條件下將大豆發(fā)酵48 h，發(fā)酵液對ACE的半抑制濃度IC50值為(0.123±0.02) mg/mL。采用液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜法對小分子多肽進(jìn)行鑒定，依據(jù)豐度和結(jié)構(gòu)特征，篩選出4個高效抑制ACE的活性多肽(EDEVSFSP、SRPFNL、RSPFNL、ENPFNL)。Moslehishad等[73]利用鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus PTCC1637從駱駝乳中提取的3–5 kDa肽段對ACE半抑制濃度IC50值為(1.45±0.02) mg/mL。Rizzello等[70]利用植物乳桿菌Lactobacillus plantarum T0A10發(fā)酵藜麥面團(tuán)，并利用反相高效液相色譜法分離水/鹽溶性提取物(WSE) 中的蛋白，并體外測定分離獲得的32個組分對1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)和2, 2?-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]，ABTS) 自由基的抑制作用及抑制亞油酸自氧化的能力。通過納米液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜連用鑒定出5個抗氧化功效較強(qiáng)的由5–9個氨基酸殘基組成的多肽(IVLVQEG、TLFRPEN、VGFGI、FTLIIN和LENSGDKKY)。Takano團(tuán)隊(duì)[74-75]發(fā)現(xiàn)酸奶能夠降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，根據(jù)替普羅肽末端7–9位的Ile-Pro-Pro序列能夠抑制ACE的活性，從瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus或德氏乳桿菌亞種Lactobacillus delbrueckii subsp. 發(fā)酵的酸奶中分離得到了具有ACE抑制活性和體內(nèi)降壓活性的Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro兩種三肽序列。He等[76]利用葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)造模的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，利用4種食品級乳酸菌Lactobacillus sp.混合發(fā)酵小麥胚芽和蘋果，并從其發(fā)酵液的醇溶組分中發(fā)現(xiàn)了可有效預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的活性多肽組分。

對于工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然活性多肽在技術(shù)經(jīng)濟(jì)性上具有競爭優(yōu)勢，但微生物分泌的其他蛋白和多糖等生物大分子會影響產(chǎn)品純度，后續(xù)分離純化過程相對復(fù)雜。此外，如何利用非轉(zhuǎn)基因技術(shù)選育高活性發(fā)酵微生物也是提高活性多肽生產(chǎn)效率的重要環(huán)節(jié)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中需要不斷地選育安全性高、轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的菌株。

2.2 自下而上的活性多肽生產(chǎn)方法

多肽合成方法一般是以氨基酸為原料，通過化學(xué)合成或生物合成方法將氨基酸按照特定序列組合成為目標(biāo)活性多肽。但這種活性多肽生產(chǎn)方法的前提是需要根據(jù)多肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，獲得活性多肽序列。

2.2.1 活性多肽的化學(xué)合成和酶催化合成

1901年Fischer等[77]通過將2, 5-二酮哌嗪(甘氨酸酐) 與鹽酸一起煮沸，成功制備了雙甘肽(Gly-Gly，Glycylglycine)，這也是最早被人類合成出的多肽。此外，F(xiàn)ischer等還創(chuàng)造性研究出在液相中合成多肽的方法被稱為液相合成法，這種方法在合成片段較短且量大的目標(biāo)多肽時更有優(yōu)勢，且純度較高。

1963年，Merrifield[78]首先提出并建立了固相合成的方法，高效地合成了四肽(Leu-Ala-Gly- Val)。其基本原理是，將氨基酸的C端固定在樹脂上，之后依次縮合氨基酸延長肽鏈。這一方法大大提高了合成長鏈多肽的效率，相比液相方法，固相合成在分離目標(biāo)多肽和副產(chǎn)物上更簡便。1966年Kung等[79]成功實(shí)現(xiàn)結(jié)晶牛胰島素合成也是基于固相合成方法。固相合成技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種長度的多肽生產(chǎn)中，當(dāng)需要合成中長肽或較小分子量蛋白時，一般優(yōu)先選擇該方法。

在發(fā)明多肽的固相合成法之后，為了提高合成的效率，Kullman[80]又提出了使用蛋白酶合成活性多肽的新思路，并于1979年率先使用木瓜蛋白酶(Papain) 和嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)等提純酶的催化合成技術(shù)，成功合成了亮腦啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) 和甲硫腦啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met)。相比于完全使用化學(xué)合成法，酶法合成多肽最突出的優(yōu)點(diǎn)是用酶催化反應(yīng)時對氨基酸選擇的特異性[45]，同時也因此降低了化學(xué)合成法對氨基酸殘基側(cè)鏈保護(hù)的要求。但是高純度高活性的特異性蛋白酶提純過程較為煩瑣，價格也較為昂貴。因此目前使用酶合成方法還未成為多肽合成的主流方法。

2.2.2 活性多肽的基因工程表達(dá)

隨著重組蛋白表達(dá)技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究開始利用重組表達(dá)技術(shù)，以原核和真核宿主細(xì)胞來生產(chǎn)目標(biāo)活性多肽[81]。然而，如果目標(biāo)產(chǎn)物為短肽，則很容易被微生物胞內(nèi)的蛋白酶降解，從而降低重組表達(dá)生產(chǎn)多肽的效率[82]。

以原核表達(dá)體系為例，在大腸桿菌中，可以使用兩種方法解決目標(biāo)多肽降解問題：1) 使用蛋白酶缺陷菌株；2) 以不溶性包涵體或串聯(lián)體形式表達(dá)多肽。Prak等[83]在使用大腸桿菌體系表達(dá)降膽固醇水平的五肽IIAEK時，利用了大豆球蛋白原的序列并串聯(lián)多個目標(biāo)IIAEK序列，最終成功生成了純凈的外泌包涵體蛋白。該包涵體可以在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下分解形成目標(biāo)五肽序列。

在真核表達(dá)體系中，常用酵母體系進(jìn)行多肽的表達(dá)。Guo等[84]將抗菌多肽天蠶素D基因整合到畢赤酵母Pichia pastoris基因組上，通過Tricine-SDS-PAGE技術(shù)證明天蠶素D被表達(dá)和分泌，并且分泌的天蠶素D對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有良好的抗菌效果。Meng等[85]利用Pichia pastoris成功表達(dá)了多肽Mytichitin-A，且產(chǎn)量達(dá)到了45.5 μg/mL，該多肽可以高效地抑制革蘭氏陽性菌而不能抑制革蘭氏陰性菌的生長。Zhang等[86]利用Pichia pastoris表達(dá)了凝集素多肽，產(chǎn)量達(dá)到了748.63 μg/mL，且表達(dá)的凝集素對革蘭氏陽性菌有很高的抑制效果。呂星星等[87]利用Pichia pastoris表達(dá)了鱖魚β-防御素，抑菌實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)的鱖魚β-防御素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和副溶血性弧菌的抑制率分別為94.34%、86.97%和85.92%。

使用基因重組技術(shù)表達(dá)活性多肽，相比化學(xué)合成多肽而言目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率比較低，因此表達(dá)體系的選擇和設(shè)計(jì)尤其重要[82]。在多肽的重組表達(dá)過程中，還會因?yàn)楸磉_(dá)體系自身的缺陷產(chǎn)生缺失或無效的多肽片段[88]，甚至宿主細(xì)胞自身代謝分泌的多肽時常也會出現(xiàn)，導(dǎo)致分離純化過程復(fù)雜。而使用無生長代謝影響的無細(xì)胞表達(dá)體系，則能夠克服上述缺點(diǎn)[89]。

2.2.3 活性多肽的無細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)

無細(xì)胞系統(tǒng)(Cell-free system) 是指利用有完整蛋白合成能力的細(xì)胞抽取物，而非活體細(xì)胞來表達(dá)蛋白質(zhì)的系統(tǒng)。這樣的表達(dá)系統(tǒng)相比于活細(xì)胞而言，蛋白產(chǎn)物純度更高、更易于分離，且能夠合成對細(xì)胞有毒性的多肽，還可以采用非天然氨基酸合成非天然活性多肽[90]。此外，因反應(yīng)體系為溶液體系，更容易控制。

螢火蟲抗菌肽(Pyrrhocoricin)[91]是從螢火蟲體內(nèi)提取的長度為20個氨基酸的抑菌肽，其功能是高效地殺傷革蘭氏陰性菌，大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌無法表達(dá)該多肽。而Taniguchi等[92]利用大腸桿菌的無細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá)了該多肽。該研究發(fā)現(xiàn)，生成的重組抗菌肽并不隨反應(yīng)時間增長而使無細(xì)胞表達(dá)體系的活性下降，同時還與自然界提取的天然螢火蟲抗菌肽有相同構(gòu)象，完全等效地抑制革蘭氏陰性菌的生長。

綜上所述，無細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)對于具有細(xì)胞毒性或是本身易被分解的目標(biāo)多肽生產(chǎn)是一個極具潛力的多肽表達(dá)系統(tǒng)。

2.3 兩類活性多肽挖掘和生產(chǎn)方法存在的問題

以天然的生物質(zhì)資源為原料，通過直接提取、酶解和微生物發(fā)酵制備多肽的自上而下方法是從自然界發(fā)現(xiàn)新的功能性多肽的重要途徑，對于豐富和發(fā)展活性多肽庫發(fā)揮了巨大作用，至今仍然被廣泛采用。但其缺點(diǎn)在于蛋白酶的選擇或發(fā)酵的菌種均需要反復(fù)試錯，活性多肽分離純化、功能發(fā)現(xiàn)和評價過程復(fù)雜，不確定性大且成本較高。并且，對于沒有參考基因組和蛋白組的大量物種，發(fā)現(xiàn)和制備功能性多肽的研發(fā)過程具有更大的不確定性。

另一方面，自下而上的多肽合成方法能夠精確地合成具有特定功能的多肽。但其前提是要預(yù)先明確多肽序列和功能活性之間的關(guān)系。而目前已知結(jié)構(gòu)的多肽庫種類仍然有限，所以可供選擇合成的多肽種類也很有限。另外，人工合成多肽一般適合于多肽藥物開發(fā)，難以直接用于功能食品和保健食品。

3 小結(jié)與展望

天然活性多肽成為生物醫(yī)藥與健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要物質(zhì)體系，具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳?，已?jīng)報道的具有功能活性的多肽僅有4 000種左右，但遠(yuǎn)低于自然界存在的蛋白資源可能發(fā)掘的種類，因此利用自然界大量未被利用的物種蛋白資源發(fā)掘和生產(chǎn)新的天然活性多肽仍然是推動多肽技術(shù)發(fā)展有效的途徑。自上而下發(fā)掘和生產(chǎn)活性多肽方法是活性多肽新功能發(fā)現(xiàn)和功能食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要路徑，但如上所述，研發(fā)過程復(fù)雜、不確定性大、成本較高，且對于沒有參考基因組和蛋白組的大量物種，發(fā)現(xiàn)和制備功能性多肽的研發(fā)過程具有更大的不確定性。而自下而上合成多肽方法的優(yōu)勢是基于已知的多肽構(gòu)效關(guān)系，可以對目標(biāo)多肽進(jìn)行精準(zhǔn)設(shè)計(jì)和人工合成，但其合成的多肽難以用于食品工業(yè)：液相或固相合成中引入了二甲基甲酰胺(DMF) 和二氯甲烷(DCM) 等有機(jī)溶劑和萃取劑，即使低于檢測限仍然無法保證最終產(chǎn)品經(jīng)服用后對人體無毒無害；而發(fā)酵生產(chǎn)用的菌種或無細(xì)胞體系同樣因?yàn)榇x毒素的種類繁雜難以分離，暫時未被食品工業(yè)認(rèn)可和接受。因此，今后需要利用天然資源發(fā)展快速發(fā)掘和生產(chǎn)活性多肽的系統(tǒng)工程技術(shù)，即食品和健康行業(yè)生產(chǎn)的活性多肽產(chǎn)品在很長一段時間內(nèi)都要以自上而下的合成為主。

如圖 2所示，人們可以將自上而下和自下而上的兩種合成方法有機(jī)結(jié)合起來，加速活性多肽的發(fā)掘和生產(chǎn)研發(fā)進(jìn)程。從自下而上的角度，對于許多沒有明確其基因組和蛋白組的物種及其蛋白資源，可以利用蛋白測序和蛋白組學(xué)技術(shù)，獲取天然蛋白序列，結(jié)合多肽構(gòu)效關(guān)系數(shù)據(jù)庫，利用機(jī)器學(xué)習(xí)等方法預(yù)測可能具有活性的多肽序列，直接通過合成方法進(jìn)行制備，經(jīng)活性檢測確認(rèn)后獲得目標(biāo)活性多肽；再從自上而下的角度，確定目標(biāo)活性多肽在其源蛋白序列上切割下來所需的酶切位點(diǎn)，進(jìn)而利用生物信息學(xué)方法選擇相應(yīng)的酶對該酶切位點(diǎn)進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)活性多肽的酶解制備。理論上，酶解制備的活性多肽與合成制備的活性多肽在活性上應(yīng)無明顯差別。相比于單一使用自下而上的方法，上下結(jié)合法更適用于合成肽無法直接應(yīng)用的場景，例如功能食品的開發(fā)；相比于自上而下的方法，上下結(jié)合法免除了傳統(tǒng)活性多肽篩選的分離純化、活性檢驗(yàn)等操作重復(fù)進(jìn)行的巨大工作量，在確定了目標(biāo)活性多肽序列的先驗(yàn)條件下進(jìn)行蛋白序列的精準(zhǔn)切割，因而大大縮短了篩選時間，達(dá)到了快速制備與驗(yàn)證目標(biāo)活性多肽的效果。

盡管目前已經(jīng)有許多研究多肽構(gòu)效關(guān)系的方法，但多肽的發(fā)掘及其作用機(jī)理闡釋的難點(diǎn)仍在于構(gòu)效關(guān)系難以明確，限制了活性多肽的發(fā)展。隨著計(jì)算機(jī)分子圖形學(xué)、分子動力學(xué)、量子化學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科的進(jìn)步，針對多種信號通路及較為復(fù)雜的多肽-靶蛋白結(jié)合構(gòu)效關(guān)系開展研究也逐漸成為可能。未來，這些構(gòu)效關(guān)系研究方法和裝備的創(chuàng)新將為圖 2所示的功能性多肽創(chuàng)制技術(shù)發(fā)展提供重要的支撐。

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