多肽合成常見(jiàn)問(wèn)題

1、肽合成的基本原理？
固相肽合成是肽合成化學(xué)的重要突破。其主要特點(diǎn)是無(wú)需純化中間產(chǎn)物，合成過(guò)程可以連續(xù)進(jìn)行，為多肽合成的自動(dòng)化奠定了基礎(chǔ)。目前多肽的全自動(dòng)合成基本上是固相合成。基本流程如下，

基于Fmoc化學(xué)合成，將目標(biāo)肽C端氨基酸的羧基與不溶性聚合物樹(shù)脂共價(jià)連接，然后以該氨基酸的氨基為起始點(diǎn)合成肽，形成肽與其他氨基酸的活化羧基結(jié)合。重復(fù)此過(guò)程即可獲得肽。根據(jù)肽的氨基酸組成不同，肽的后處理方法不同，純化方法也不同。

2、生產(chǎn)肽的常用方法有哪些？
線性肽的肽鏈采用Fmoc固相合成法延長(zhǎng)，氨基酸從C端到N端逐步連接。開(kāi)始時(shí)，第一個(gè)氨基酸通過(guò)酸敏感接頭連接到不溶性支持樹(shù)脂上。用六氫吡啶除去 Fmoc 保護(hù)基后，連接第二個(gè) Fmoc 保護(hù)的氨基酸。連接方式包括預(yù)激活或“一鍋”等。連接目標(biāo)序列后，用TFA將肽鏈從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，得到粗品。

3、不同實(shí)驗(yàn)如何選擇肽的純度？
肽的純度是一個(gè)很重要的指標(biāo)，純度的選擇取決于實(shí)驗(yàn)的目的。對(duì)于敏感性較低的篩選試驗(yàn)，建議使用粗品或> 75%，對(duì)于免疫水平，建議使用> 85%。對(duì)于受體-配體相互作用研究、生物測(cè)定或細(xì)胞水平研究，推薦值 >95%，對(duì)于結(jié)構(gòu)研究，推薦值 >98%。

4、什么是肽的凈含量（肽含量），它的意義是什么？
干肽的重量不僅含有肽，還含有一些非肽成分，如水、吸收的溶劑、配位離子和鹽。肽的凈含量是指其中肽的重量百分比。該百分比的值可以在 50% 到 90% 的范圍內(nèi)，具體取決于純度、序列以及合成和純化。不要將肽的凈含量與肽的純度混淆。它們是兩個(gè)完全不同的概念。純度通常由 HPLC 測(cè)定。純度定義為肽樣品中序列正確的組分的百分比，而肽的凈含量是指樣品中肽物質(zhì)相對(duì)于非肽物質(zhì)的百分比。肽的凈含量通常通過(guò)氨基酸組成分析或紫外分光光度法測(cè)定。在某些對(duì)肽濃度敏感的實(shí)驗(yàn)中，該信息對(duì)于計(jì)算肽濃度非常重要。

5、如果肽純度為 95%，剩下的 5% 是多少？
肽的純度通常由 HPLC 測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)乙腈梯度為每分鐘 1%。在合成過(guò)程中，氨基酸之間的交聯(lián)效率并不總是達(dá)到100%，從而產(chǎn)生了一系列氨基酸缺失雜質(zhì)。這些氨基酸缺陷雜質(zhì)大部分在純化過(guò)程中被去除，但其色譜性能與目標(biāo)肽非常相似。這些氨基酸缺失在剩余的百分之幾中保留在肽樣品中。

6、非 HPLC 純化肽中存在哪些雜質(zhì)？
粗品級(jí)和脫鹽級(jí)中的肽和非肽雜質(zhì)：如非全長(zhǎng)肽和一些肽后處理原料如DTT、TFA等。

7、多長(zhǎng)的肽段合適？
肽合成需要考慮肽的長(zhǎng)度、電荷和疏水性等因素。長(zhǎng)度越長(zhǎng)，粗品的純度和收率越低，提純難度越大，合成失敗的概率越大。當(dāng)然，多肽功能區(qū)的序列是不能改變的，但為了多肽的順利合成，有時(shí)需要在功能區(qū)的上下游添加一些輔助氨基酸，以提高多肽的溶解度和親水性. 如果肽段太短，合成可能會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。主要問(wèn)題是合成的肽在后處理過(guò)程中存在一定的難度。5肽以下的肽一般需要疏水性氨基酸，否則后處理比較困難。

8、如何從肽序列中確定肽的溶解度？
如果肽中含有高比例的疏水性氨基酸，如 Leu、Val、IIe、Met、Phe 和 Trp，則很難溶解在水溶液中或根本無(wú)法溶解。這些氨基酸，無(wú)論是純化的還是合成的，可能有問(wèn)題。
一般疏水氨基酸比例<50%，連續(xù)5個(gè)氨基酸不能疏水，帶電荷氨基酸比例（正電荷K、R、H、N端，負(fù)電荷D、E、C端) 達(dá)到 20%，在肽 N 或 C 中，如果可以增加極性氨基酸，也可以提高溶解度。

9、為什么合成含有 Cys、Met 或 Trp 的肽很困難？
合成含有Cys、Met或Trp的肽并獲得高純度產(chǎn)品是困難的。主要原因是這些基團(tuán)不穩(wěn)定，容易氧化。應(yīng)特別注意這些肽的使用和儲(chǔ)存，避免重復(fù)打開(kāi)蓋子。

10、為什么某些肽的合成收率或純度較低？
肽合成和引物合成有比較大的區(qū)別。不能合成的引物很少，但往往有不能合成的肽。由于Val、Lle、Tyr、Phe、Trp、Leu、Gln、Thr是直系同源或重復(fù)的氨基酸，在合成過(guò)程中肽鏈不能完全溶解，合成效率降低。在以下情況下，產(chǎn)品的合成效率和純度都比較低，如：重復(fù)pro、Ser-Ser、重復(fù)ASP、四連續(xù)Gly等。

11、如何純化肽？
通過(guò)反相柱（如C8、C18等）在214 nm處純化肽。緩沖系統(tǒng)通常是含有 TFA（pH 值為 2.0）的溶劑。緩沖液 A 在 ddH 2中含有 0.1% TFAO, 緩沖液 B 含有 1% TFA / ACN / ph2.0。Buffer A 用于在純化前溶解肽；如果溶液不好，用Buffer B溶解，再用Buffer A稀釋。對(duì)于強(qiáng)疏水性肽，有時(shí)需要添加少量甲酸或乙酸。多肽粗品的HPLC分析，如果多肽不長(zhǎng)（15aa以下），一般會(huì)有一個(gè)主峰，主峰通常是全長(zhǎng)產(chǎn)物；對(duì)于20aa以上的長(zhǎng)肽，如果沒(méi)有主峰，HPLC需要匹配質(zhì)量確定分子量，然后確定哪個(gè)峰是要合成的肽。

12、適合免疫的肽多長(zhǎng)時(shí)間？
一般約為10-15個(gè)氨基酸。當(dāng)然氨基酸數(shù)量越多，免疫效果越好，但合成費(fèi)用也會(huì)增加。然后預(yù)計(jì)映射肽的長(zhǎng)度將超過(guò) 15 個(gè)氨基酸。此外，10個(gè)氨基酸以下的肽在免疫方面的效果較差。

13、肽的外觀是什么？
肽是粉末狀的，通常是白色的。肽粉的顏色隨著成分的不同而不同，比如一些帶有FITC修飾的黃綠色。

14、如何溶解多肽？
溶解多肽非常復(fù)雜，通常很難一次確定合適的溶劑。一般是先取一點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，不要完全溶解后再確定合適的溶劑。

以下方法可幫助您選擇合適的溶劑：

確定肽的比電荷，將酸性氨基酸ASP（D）、Glu（E）和C端COOH設(shè)置為-1；堿性氨基酸Lys(K)、Arg(R)、His(H)和N端NH2為+1，其他氨基酸的電荷為0。計(jì)算電荷數(shù)。
如果凈電荷數(shù) > 0，則肽呈堿性，用水溶解：如果不溶或不太溶，加入乙酸（10% 以上）；如果肽尚不溶解，則加入少量 TFA（25 ul）溶解，然后加入 500 ul 水稀釋。
若凈電荷數(shù)<0，肽呈酸性，溶于水；如果不溶解或不太溶解，加入氨水（25 ul）溶解，然后加入 500 ul 水稀釋。
如果凈電荷數(shù)=0，肽是中性的，一般需要用乙腈、甲醇或異丙醇、DMSO等有機(jī)溶劑溶解。也有人提出需要尿素來(lái)溶解疏水性強(qiáng)的肽.

15、如何儲(chǔ)存合成肽？
多肽長(zhǎng)期保存一般需要避光保存，短期保存應(yīng)在–20℃和4℃保存。肽可以在室溫下短時(shí)間運(yùn)輸。肽在-20℃下是穩(wěn)定的，尤其是冷凍干燥并儲(chǔ)存在干燥器中。冷凍干燥的肽在暴露于空氣之前可以在室溫下儲(chǔ)存。這將減少濕度的影響。當(dāng)無(wú)法進(jìn)行凍干時(shí)，最好的方法是少量?jī)?chǔ)存樣品。

對(duì)于含有 Cys、Met 或 Trp 的肽，脫氧緩沖液對(duì)于它們的溶解是必不可少的，因?yàn)檫@些肽很容易被空氣氧化。在封端之前緩慢流過(guò)肽的氮?dú)饣驓鍤庖部梢詼p少氧化。含有 Gln 或 Asn 的肽也很容易降解，與沒(méi)有這些問(wèn)題和簡(jiǎn)單肽的肽相比，所有這些肽的壽命有限。

16、如何處理肽的兩端？它是免費(fèi)的還是受保護(hù)的？
肽用于模擬蛋白質(zhì)。為了模擬蛋白質(zhì)的表達(dá)，我們需要合成與蛋白質(zhì)具有相似結(jié)構(gòu)和電荷的肽。當(dāng)一個(gè)肽從蛋白質(zhì)中“切出”時(shí)，兩端的電荷數(shù)將與基因體蛋白的電荷數(shù)不同。我們需要改變合成策略以使它們保持一致。一般來(lái)說(shuō)，如果來(lái)自蛋白質(zhì)的C端，N端被乙?；帘?；如果它來(lái)自蛋白質(zhì)的N端，則C端被酰胺化屏蔽；如果它來(lái)自蛋白質(zhì)的中間部分，則兩端被乙酰化和酰胺化屏蔽。

17、什么是電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization，EIS）？
EIS可以產(chǎn)生多價(jià)離子化的蛋白質(zhì)或多肽，可以分析相對(duì)分子量為1×10 5的蛋白質(zhì)，分辨率為1500-2000 amu。準(zhǔn)確率約為 0.01%。EIS 更適用于高分子量蛋白質(zhì)的在線分析，需要?dú)饣蛴袡C(jī)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行敏化。

18、什么是基質(zhì)輔助激光解離/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS)？
MALDI-TOF是目前蛋白質(zhì)鑒定中準(zhǔn)確測(cè)定分子質(zhì)量的一種手段，特別適用于測(cè)定混合蛋白肽種類(lèi)的相對(duì)分子質(zhì)量，具有良好的靈敏度和分辨率。它是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的必備工具。一種與液相色譜同時(shí)結(jié)合的聯(lián)用技術(shù)可以高效地鑒定肽種類(lèi)。尤其是當(dāng)質(zhì)譜技術(shù)的各種原理串聯(lián)應(yīng)用時(shí)，不僅可以獲得肽的相對(duì)分子質(zhì)量信息，還可以確定其序列結(jié)構(gòu)，該技術(shù)將在未來(lái)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有決定性意義。

19、什么是高效液相色譜（HPLC）？什么是反相高效液相色譜 (RP-HPLC)？
高效液相色譜的出現(xiàn)為多肽的分離提供了一種有利的方法。與其他化合物相比，在合適的色譜條件下，蛋白質(zhì)和多肽的分離可以在短時(shí)間內(nèi)完成。更重要的是，高效液相色譜法可以大規(guī)模生產(chǎn)生物活性肽。因此，許多學(xué)者為尋找多肽分離制備的最佳條件做了大量工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類(lèi)、如何分析確定是目前的研究?jī)?nèi)容。

反相高效液相色譜（RP-HPLC）：結(jié)果與保留值的關(guān)系：用RP-HPLC分離肽，需要確定不同結(jié)構(gòu)的肽在柱上的保留。為了獲得一系列保留系數(shù)，Wilce 等人。采用多元線性回歸法分析了2106種多肽的保留性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，得到了不同氨基酸組成與保留系數(shù)之間的關(guān)系?？蓽p少2-20個(gè)氨基酸肽中極性氨基酸殘基的保留時(shí)間；在10-60個(gè)氨基酸肽段中，更多的非極性氨基酸也可以減少在柱上的保留時(shí)間，而在5-25個(gè)氨基酸肽段中，更多的非極性氨基酸可以延長(zhǎng)在柱上的保留時(shí)間。

20、為什么在 RP-HPLC 中使用梯度洗脫？
目前，RP-HPLC是研究多肽相關(guān)物質(zhì)合成最常用的方法。但由于合成多肽中相關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)不同，單純的等度洗脫法難以全面檢測(cè)產(chǎn)品中的各類(lèi)有機(jī)雜質(zhì)。

21、質(zhì)譜中如何確定單同位素峰和平均同位素峰？
在低分辨率的質(zhì)譜中，顯示的峰通常是平均同位素峰。然而，質(zhì)譜（如MALDI-TOF）的分辨率非常高。一般的小分子（如肽段）常含有4-5個(gè)同位素峰，其中分子量最小的是單同位素峰。使用質(zhì)譜法檢測(cè)大分子（如完整蛋白質(zhì)）時(shí)，同位素峰的數(shù)量非常多，在圖譜上難以區(qū)分。在這種情況下，使用平均同位素峰更有意義。

22、同位素峰之間是否有 1 Da 的差異？
同位素肽的質(zhì)量（m）一般相差1 Da，但質(zhì)譜檢測(cè)到的峰是肽的質(zhì)荷比（m/z）而不是質(zhì)量本身，當(dāng)肽的質(zhì)荷比差異小于1時(shí)有多項(xiàng)收費(fèi)。如果檢測(cè)到的肽帶一個(gè)電荷，則同位素峰之間的差值為 1；如果檢測(cè)到的肽段有兩個(gè)電荷，則同位素峰之間的差值為 0.5；如果檢測(cè)到的肽段帶三個(gè)電荷，則同位素峰之間的差值為 0.33；等等。因此，從同位素峰之間的距離，我們可以推斷肽的帶電狀態(tài)（z），從而推斷肽的單個(gè)同位素質(zhì)量[（m/z）*z]。

23、單同位素峰一定是最高的嗎？
單同位素峰必須在一組峰中具有最低的質(zhì)荷比，但不一定是最高的。當(dāng)肽的分子量較小時(shí)，肽中的原子總數(shù)也較少，整個(gè)肽含有同位素原子的概率較小。此時(shí)，單同位素峰往往是最高峰。當(dāng)肽的分子量增加時(shí)，攜帶同位素原子的概率增加。在這種情況下，+1 Da 甚至+2 Da 的同位素峰可能是最高的。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，當(dāng)多肽的分子量大于2500 Da時(shí)，該峰不是單同位素峰。

24、除了 HPLC 和 MS，還有哪些其他肽分析方法可用？
還可提供水餾分、離子色譜、元素分析、氨基酸組成分析、圓二色譜、NMR、IR、UV、內(nèi)毒素、微生物等分析。

25、肽通常攜帶的抗衡離子是什么？
多肽凍干粉一般配三氟乙酸鹽，如果是做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建議換成乙酸鹽或鹽酸鹽。

26、可以提供哪些同位素標(biāo)記的肽？
可以提供一些穩(wěn)定的同位素修飾肽，主要包括N15、C13??和氘修飾。由于穩(wěn)定同位素氨基酸原料價(jià)格昂貴，建議選擇一些簡(jiǎn)單的氨基酸進(jìn)行標(biāo)記，如Gly、Val、Phe、Leu、Ala等。

27、影響多肽穩(wěn)定性的因素有哪些？
影響合成肽穩(wěn)定性的因素包括脫酰胺、氧化、水解、二硫鍵錯(cuò)配、消旋化、β-消除、聚集等。合成肽最常見(jiàn)的降解產(chǎn)物是脫酰胺產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物和水解產(chǎn)物。在各種氨基酸中，天冬酰胺和谷氨酰胺容易脫酰胺（特別是在高pH和高溫下）；蛋氨酸、半胱氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸最容易被氧化，對(duì)光敏感；天冬氨酸形成的肽鏈容易斷裂，尤其是ASP-Pro和ASP-Gly肽鍵。肽的聚集主要是由疏水相互作用引起的。雖然目前很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)哪些肽段容易聚集，至少對(duì)于一些中長(zhǎng)肽段來(lái)說(shuō)，

28、Fmoc/tBu固相合成（SPPs）如何選擇樹(shù)脂？
C端羧肽合成可選用Wang樹(shù)脂；對(duì)于C端酰胺肽的合成，可選擇Rink Amide AM Resin或Rink Amide MBHA Resin；對(duì)于全保護(hù)肽的合成，我們可以選擇2-Cl Trt Resin。

29、樹(shù)脂的參數(shù)是什么？參數(shù)的含義是什么？
一般樹(shù)脂的參數(shù)包括載量、目數(shù)和規(guī)格，如1% DVB。
載量：?jiǎn)挝粸閙mol/g，即每克樹(shù)脂存在多少毫摩爾官能團(tuán)。
目數(shù)：粒度一般為100-200目，數(shù)值越大，顆粒越細(xì)。
1% DVB：交聯(lián)劑二乙烯基苯在苯乙烯和二乙烯基苯共聚物中的比例。

30、Fmoc保護(hù)氨基酸樹(shù)脂的負(fù)載量計(jì)算方法有哪些？
Fmoc保護(hù)氨基酸樹(shù)脂載量的計(jì)算一般有兩種方法，一種是增重法，增加的重量除以分子量，再除以樹(shù)脂的總重量。另一種是通過(guò)紫外分析。目前我司提供UV分析加載值。

31、什么樣的肽可以通過(guò)紫外分析來(lái)計(jì)算肽含量？
如果肽段序列中含有Trp或Tyr，可用紫外法分析肽段的含量，根據(jù)摩爾消光系數(shù)：
色氨酸 5,560 AU/mmole/ml
酪氨酸 1,200 AU/mmole/ml
（280 nm at 中性pH使用 1 cm 比色皿）
肽的摩爾消光系數(shù)可以根據(jù)每個(gè)色氨酸或酪氨酸的系數(shù)相加，然后根據(jù)在 280 nm 處測(cè)得的吸光值按公式計(jì)算。
mg 肽/ml = (A280 x DF x MW) / e
A280，280 nm 處的實(shí)際吸收值（1 cm 池），
DF，稀釋因子，
MW，肽的分子量
e，肽的摩爾消光系數(shù)

32、肽與其他化合物或載體的結(jié)合應(yīng)考慮哪些因素？
一些肽往往需要與一些具有特定功能的藥物或化合物，或一些載體連接。這些過(guò)程需要化學(xué)鍵結(jié)合。通常，當(dāng)肽具有氨基或羧酸官能團(tuán)時(shí)，可以考慮相應(yīng)的羧酸或氨基進(jìn)行縮合。另一種選擇是在 pH 8 的環(huán)境中將馬來(lái)酰亞胺與硫醇連接。肽可以用 Cys 或馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)進(jìn)行修飾。馬來(lái)酰亞胺改性通?？梢酝ㄟ^(guò) 3-馬來(lái)酰亞胺丙酸 (CAS 7423-55-4) 實(shí)現(xiàn)。

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