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專(zhuān)注多肽 服務(wù)科研
實(shí)驗(yàn)技術(shù):多肽合成是一個(gè)固相合成順序一般從C端(羧基端)向 N端(氨基端)合成。過(guò)去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱(chēng)為液相合成法。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來(lái),經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn) 和完善,到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù),表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。多肽合成總的來(lái)說(shuō)分成兩種:固相合成和液相多肽合成。
實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理:
多肽合成儀以固相合成為反應(yīng)原理,在密閉的防爆玻璃反應(yīng)器中使氨基酸按照已知順序(序列,一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端)不斷添加、反應(yīng)、合成,操作最終得到多肽載體。固相合成法,大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生,參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是保護(hù)的。羧基端是游離的,并且在反應(yīng)之前必須活化。
實(shí)驗(yàn)操作流程:
1、去保護(hù):Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去除氨基的保護(hù)基團(tuán)。
2、激活和交聯(lián):下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?;罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián),形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán):這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。
3、洗脫和脫保護(hù):多肽從柱上洗脫下來(lái),其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑(TFA)洗脫和脫保護(hù)。
多肽修飾類(lèi)型:
1、C端標(biāo)記技術(shù) :
C端酰胺化(Amidation,C-termainal)、醛基化(Aldehydes)、醇基化(Alcohols)、pNA (p-Nitroanilide)
AMC、AFC、巰基乙胺化(Cysteamide)、酯基化(Ester)、N-烷基化(N-Alkyl Amides)等
2、N端標(biāo)記技術(shù) :
乙酰化Acetylated (Acetylated)、Palmytolyl、HYNIC、生物素標(biāo)記(Biotinylated)、Br乙?;˙romoacetylated)
螯合反應(yīng)(DOTA,DTPA conjugated)、甲醛化(Formylated)、十四烷基、十八烷基化(Myristoylated)
琥珀?;?、棕櫚酸化、蘋(píng)果酸化、脂肪酸化等(Succinylated)
3、熒光標(biāo)記修飾:
C端修飾:AFC, AMC, Dap(Dnp), Lys(Dye), pNA, Rh110
N端修飾:Biotin, Cy3, Cy5, Texas Red, 5-Tamra, 5-Fam,5-Fitc等
Rhodamine 110 and Rhodamine B Luciferin, EDANS
FAM, FITC, MCA, Rox, Sulforhodamine 101, 5-TAMRA
4、環(huán)化反應(yīng):
首尾成環(huán),中間成環(huán),特殊成環(huán)(N -> C or Head to Tail)
2對(duì)二硫鍵,3對(duì)二硫鍵(Disulfide (S-S bond formation) .Trisulfide formation)
天然產(chǎn)物活性肽成環(huán)(Cyclic-natural peptides )
5、甲基化修飾:
側(cè)鏈甲基化Lys(For),Lys(Me), Lys(Me)2, Lys(Me)3, Arg(Me)2 symmetrical, D-Tyr(Me),D-Tyr(Et)
N端甲基化(N-Me-Arg,N-Me-Asp, N-Me-Glu, N-Me-Leu, N-Me-Nle, N-Me-Nva, N-Me-Phe, N-Me-S N- Me-Ser, N-Me-Trp, N-Me-Thr, N-Me-Val)
6、幾種特殊修飾:
各 種偶聯(lián)(BSA, KLH conjugated peptides for antibody production )、磷酸化(Phosphoserine, Phosphothreonine, Phosphotyrosine)、磺化(Sulfated Tyrosine or Serine)、MAPS (Multiple Antigenic Peptide)、糖肽(Glycopeptides)、 PEG修飾(PEGylation)
實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):
客戶(hù)提供:
1、多肽序列、數(shù)量、純度及特殊要求
2、凍干多肽可在-20度保存或室溫保存
3、溶液肽遠(yuǎn)比凍干形式不穩(wěn)定,溶液應(yīng)為中性PH(5-7)-20度保存。
4、為避免樣品的反復(fù)凍融,最好分成小樣存放。